Myogenin 在不同發(fā)育階段小鼠骨骼肌中的表達(dá)差異

任華偉，薛霖莉，2，曹 靖，李藝?yán)?，冀云燕，羅小毛，于秀菊，赫曉燕，王海東

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷030800；3.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京102442）

MyoD 家族是近年來分子生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和前沿，目前已知成員包括MyoD、Myogenin、Myf5、Myf6。MyoD 家族成員的氨基酸序列的同源性高達(dá)80%，它們都有68 個殘基的同源片段[1-3]；其可激活靜止?fàn)顟B(tài)的肌肉特有基因，并與增強(qiáng)子結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄、促進(jìn)某些細(xì)胞向骨骼肌分化[4]。不僅是骨骼肌的生長發(fā)育，在骨骼肌受損后肌纖維的修復(fù)過程中該家族也起著重要作用。

Myogenin 是MyoD 家族中的重要成員之一，在敲除Myogenin 基因的研究中，小鼠肌組織生成的成肌細(xì)胞數(shù)量不會改變，但其卻不能分化為肌細(xì)胞[5-6]，說明成肌細(xì)胞向成熟肌纖維分化過程中Myogenin起了主導(dǎo)作用。

NCVILLLC 等[7]在去神經(jīng)造成的骨骼肌MRFS基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)效果的試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，Myogenin 基因的反應(yīng)很快并且增幅很高，其為MyoD 家族中在全部骨骼肌的細(xì)胞系中均能表達(dá)的唯一成員。HASTT 等[8]在小鼠Myogenin 蛋白消除試驗(yàn)中表明，Myogenin 蛋白在肌細(xì)胞的分化過程中起主要調(diào)控的作用，是骨骼肌分化的必需因子，其作用不能被其他肌源性調(diào)節(jié)因子所代替。有研究結(jié)果表明，在力竭游泳實(shí)驗(yàn)恢復(fù)的不同時(shí)期及肌肉損傷后的不同時(shí)期，骨骼肌成肌調(diào)節(jié)因子Myogenin 蛋白表達(dá)呈現(xiàn)規(guī)律性變化[9]，表明Myogenin 因子在此過程中具有重要的作用，可作為一項(xiàng)重要的醫(yī)學(xué)觀測指標(biāo)，因此研究其在不同月齡小鼠的骨骼肌中的表達(dá)在治療肌肉疾病中具有重要的意義。此前，有學(xué)者研究Myogenin 基因在五指山豬與長白豬骨骼肌當(dāng)中的表達(dá)對肉豬發(fā)育產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，Myogenin 基因不但影響骨骼肌表達(dá)的特異表型，而且還會對豬肉的產(chǎn)量和品質(zhì)造成顯著影響[10]。TE 等[11]對14 199 個樣本Myogenin 基因3′端進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，Myogenin 基因型對初生質(zhì)量、日增質(zhì)量、酮體質(zhì)量及瘦肉率具有明顯的影響。對Myogenin 基因的深入研究將有助于推動當(dāng)前養(yǎng)殖行業(yè)的發(fā)展與進(jìn)步。

基于此前學(xué)者對Myogenin 的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，有關(guān)動物機(jī)體肌肉發(fā)育與該基因表達(dá)變化之間的關(guān)系目前尚無人研究。

本試驗(yàn)以處于幼年、性成熟、體成熟以及老年4 個不同發(fā)育階段的小鼠為研究對象，通過采用H.E.染色、組織化學(xué)免疫技術(shù)及熒光定量PCR 技術(shù)研究Myogenin 基因在小鼠骨骼肌中的表達(dá)差異，旨在對之后進(jìn)一步研究動物骨骼肌生長發(fā)育機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物

隨機(jī)選取品系為C57BL/6J 的健康小鼠（購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司），包含1 周齡幼鼠、3～4 周齡性成熟小鼠、6～8 周齡體成熟小鼠和8 月齡老年鼠各3 只。采用斷頸法處死小鼠，分別取其兩側(cè)骨骼肌，其中，左側(cè)采用Bouin's固定液進(jìn)行固定，24 h 后采用梯度酒精和二甲苯進(jìn)行脫水透明，制作成厚度為6 μm 的組織切片用作之后H.E.的染色和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)；右側(cè)即刻置于液氮內(nèi)進(jìn)行冷凍保存，用作提取總RNA 以及總蛋白。

1.2 試劑與儀器

試驗(yàn)所用試劑和儀器列于表1。

表1 試驗(yàn)試劑及試驗(yàn)儀器

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 H.E.染色 將不同生長周期小鼠的骨骼肌組織塊用Bouin's 液固定后處理并切片，利用二甲苯和由高到低的梯度酒精脫蠟，蘇木精染核40 s 后用蒸餾水返藍(lán)，用由低到高梯度酒精脫水至90%，利用伊紅進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)著色5～10 s，光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況，繼續(xù)脫水至無水酒精，并用二甲苯進(jìn)行組織透明，最后中性樹脂封片。

1.3.2 免疫組織化學(xué)試驗(yàn) 將幼年、性成熟、體成熟和老年小鼠骨骼肌的石蠟切片用二甲苯和梯度酒精脫蠟處理，在組織上滴加solution A，37 ℃恒溫箱反應(yīng)10 min 封閉內(nèi)源性過氧化物酶；使用PBS緩沖液沖洗3 次；滴加封閉液solution B，然后置于恒溫箱10 min；陽性滴加一抗（MyoG 抗體和PBS 緩沖液以1∶30 比例配制），陰性滴加PBS 對照，4 ℃孵育14 h 后，37 ℃恒溫箱復(fù)溫30 min，用PBS 緩沖液沖洗3 次，濾紙吸去切片組織周圍液體，滴加二抗（solution C），恒溫箱中靜置孵育30 min；同樣濾紙吸去組織周圍液體，滴加solution D，恒溫箱中反應(yīng)10 min，用PBS 緩沖液沖洗3 次，濾紙吸去組織周圍液體，滴加DAB 顯色劑，保持避光，當(dāng)觀察到組織變色并不再加深時(shí)，用PBS 沖洗3 次，用蘇木精染核3 min，蒸餾水沖洗3 次。使用梯度酒精和二甲苯脫水透明，最后用中性樹脂進(jìn)行封片。

1.3.3 總RNA 的提取 在液氮條件下快速將組織塊研磨成粉末并移入1 mL 的Trizol 裂解液中混勻。加入200 μL 氯仿，混合至溶液呈現(xiàn)乳粉色，冰上靜置5 min，12 000 g 4 ℃離心15 min 可見溶液分層，上層為含有RNA 的無色上清水樣層，中層含有白色蛋白質(zhì)和DNA，下層為帶有顏色的有機(jī)相。緩慢吸取上清液移入新離心管中，加入500 μL 異丙醇，混勻后冰上靜置10 min，12 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 mL 的70%冰乙醇上下顛倒充分洗滌離心管管壁，7 500 g 4 ℃離心5 min 后盡量棄去上清液，小心吸去殘液并快速干燥幾分鐘，用適量的DEPC 水溶解RNA 沉淀，離心混勻后用核酸濃度檢測儀測定總RNA 濃度以及OD260/OD280值。

1.3.4 反轉(zhuǎn)錄 將提取的總RNA 稀釋至1 000 ng/μL 備用，通過2 步法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：第1 步，去除基因組DNA。加入2 μL 5×g DNA Eraser Buffer、1 μL gDNA Eraser 和1 μL RNA 樣品，RNAse Free H2O 補(bǔ)充至10 μL體系，PCR 儀中42 ℃反應(yīng)2 min。第2 步，反轉(zhuǎn)錄，基于第1 步反應(yīng)體系，加入1μL 的Rrime Scripe RTEnzyme MixⅠ、1 μL 的RT Rrime mix、4 μL的5×prime scripe Buffer 2 以及4 μL RNAse Free H2O 將體系補(bǔ)充至20 μL，PCR 儀中37 ℃15 min、85 ℃5 s。反應(yīng)結(jié)束后，測定cDNA 濃度，并稀釋至100 ng/μL 備用。

1.3.5 普通PCR 通過普通PCR 測定目的Myogenin 引物的最適擴(kuò)增溫度，其體系列于表2。

表2 普通PCR 體系（10 μL）

設(shè)置8 個溫度梯度：53，54，55，56，57，58，59，60 ℃。梯度PCR 儀設(shè)置變性、退火、延伸3 個環(huán)節(jié)，共擴(kuò)增40 個循環(huán)，反應(yīng)條件為：95 ℃起始5 min；95 ℃變性30 s，53～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s；72 ℃終延伸5 min。120 V 電壓進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳20 min，通過紫外透視儀和相應(yīng)軟件AlphaEase-FC 觀察比對，從而確定Myogenin 引物的最佳退火溫度。

1.3.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)GenBank 錄入的Myogenin 基因序列的保守區(qū)域，運(yùn)用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)小鼠Myogenin 基因的特異性引物以及內(nèi)參引物β-Actin（華大基因公司合成），引物序列列于表3。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測，對起始模板進(jìn)行定量和定性分析，反應(yīng)體系列于表4。

表3 目的基因及內(nèi)參基因引物序列

表4 熒光定量PCR 體系（10 μL）

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段小鼠骨骼肌的形態(tài)特征

H.E.染色的切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幼年期與性成熟時(shí)期的小鼠骨骼肌細(xì)胞間隙較小，肌纖維排列緊密，年齡越小的小鼠骨骼肌細(xì)胞胞核越多，并且多見中央核，隨著年齡的增長，老年小鼠的肌細(xì)胞間隙明顯增寬，肌纖維排列疏松，肌束間隙明顯增大，細(xì)胞核稀少并逐漸邊緣化（圖1）。

2.2 不同發(fā)育階段小鼠骨骼肌中Myogenin 的表達(dá)定位

將免疫組織化學(xué)切片放置在顯微鏡下觀察并拍照，可見滴加一抗的陽性組與陰性組有明顯不同，其中，陽性組細(xì)胞胞核呈現(xiàn)藍(lán)紫色，其胞質(zhì)有明顯黃染；陰性組骨骼肌組織未見此反應(yīng)。通過免疫組織化學(xué)染色可以看出，Myogenin 在小鼠骨骼肌的4 個發(fā)育階段均有表達(dá)，且在幼年和性成熟時(shí)期表達(dá)量較體成熟期和老年時(shí)期要高，其表達(dá)位置為細(xì)胞質(zhì)（圖2）。

2.3 Myogenin mRNA 在不同發(fā)育階段小鼠骨骼肌中的表達(dá)差異分析

2.3.1 Myogenin 在不同發(fā)育階段小鼠骨骼肌中的表達(dá) 提取出的總RNA 經(jīng)過DEPC 水溶解后用核酸濃度檢測儀進(jìn)行監(jiān)測，其結(jié)果列于表5。

表5 總RNA 的濃度及OD260/OD280 值

經(jīng)過PCR 儀將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，用核酸濃度檢測儀測定cDNA 的濃度，其結(jié)果列于表6。

表6 cDNA 的濃度及OD260/OD280 比值

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)結(jié)果（圖3），第8 條帶清晰明顯，并且無拖尾現(xiàn)象，可以確定Myogenin的最佳退火溫度為60 ℃。

2.3.2 Myogenin mRNA 在不同發(fā)育階段小鼠骨骼肌中的表達(dá)差異 根據(jù)Myogenin 基因和內(nèi)參基因的溶解曲線可知（圖4），該定量PCR 結(jié)果具有特異性，從擴(kuò)增曲線來看，目的基因從第24 個循環(huán)開始擴(kuò)增，內(nèi)參基因從第14 個循環(huán)開始擴(kuò)增，在擴(kuò)增過程中有較為一致的上升期和平臺期，根據(jù)該曲線得出的CT 值，由2-ΔΔCT法計(jì)算出目的和內(nèi)參基因在不同發(fā)育階段小鼠骨骼肌中的相對表達(dá)水平，結(jié)果顯示，體成熟和老年小鼠骨骼肌組織中Myogenin 的表達(dá)量與幼年小鼠相比呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01），隨著小鼠發(fā)育成熟，Myogenin 在小鼠骨骼肌組織中表達(dá)水平基本呈現(xiàn)下降趨勢，幼鼠表達(dá)量極高，老年鼠表達(dá)量最低，表明Myogenin 與骨骼肌的成熟發(fā)育相關(guān)（圖5）。

3 結(jié)論和討論

骨骼肌是由具有收縮能力的肌細(xì)胞組成，它是動物機(jī)體中最大的肌肉組織、不分支，并且有明顯的橫紋。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及基因敲除技術(shù)和基因打靶技術(shù)的進(jìn)步，人們對骨骼肌的生長與發(fā)育在分子水平上有了更加深入的了解[12-14]。有后肢懸垂對Myogenin 基因影響的研究[15]、運(yùn)動狀態(tài)對Myogenin 的影響研究[16]；曾纓等[17]研究認(rèn)為，Myogenin 基因在不同月齡的DMD 模型鼠身上的表達(dá)，Myogenin 在1 月齡的mdx 小鼠身上表達(dá)最強(qiáng)烈，13 月齡仍有表達(dá)，但正常C57 鼠幾乎不表達(dá)[17]。這些研究表明，Myogenin 基因表達(dá)量不僅與其運(yùn)動狀態(tài)、病理狀況、張應(yīng)力及乙酰膽堿刺激等影響有關(guān)，更與機(jī)體的發(fā)育階段相關(guān)。

本試驗(yàn)分別提取了幼年時(shí)期、性成熟時(shí)期、體成熟時(shí)期以及老年時(shí)期4 個有代表性的不同發(fā)育階段小鼠骨骼肌組織，通過H.E.染色、免疫組化及定量PCR 觀察Myogenin 基因的表達(dá)水平。有學(xué)者研究生長激素對骨骼肌細(xì)胞形態(tài)的影響，在注射生長激素8 周后，骨骼肌纖維排列松散，細(xì)胞核數(shù)量減少且體積變小[18]。通過H.E.染色的切片結(jié)果可以看出，肌肉由數(shù)量不等的肌束構(gòu)成，H.E.染色切片空白的間隙即為肌束膜，是由含有血管和神經(jīng)的結(jié)締組織構(gòu)成。通過不同發(fā)育階段的小鼠腓腸肌H.E.染色切片對比可以看出，幼年和性成熟時(shí)期的肌束間隙比較小，肌束較為緊密，而體成熟和老年時(shí)期的骨骼肌肌束稀少并且間隙比較寬大，細(xì)胞核數(shù)目也明顯減少，研究結(jié)果與前人研究結(jié)果吻合。廖艷萍[19]對發(fā)育期小鼠大強(qiáng)度離心運(yùn)動對Myogenin 基因表達(dá)影響的研究表明，該基因在幼年期小鼠骨骼肌有表達(dá)，達(dá)雨等[20]對功能矯形對青春期小鼠Myogenin 表達(dá)影響的研究表明，該基因在性成熟及體成熟時(shí)期有表達(dá)。本試驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)試驗(yàn)的切片可以看出，Myogenin 基因在4 個不同的發(fā)育階段均有表達(dá)，說明Myogenin 基因貫穿了動物體發(fā)育的一生，是骨骼肌發(fā)育所必需的，與其結(jié)論基本一致。有試驗(yàn)表明，Myogenin 基因表達(dá)與動物年齡有關(guān)，孫偉等[21]對Myogenin 基因不同日齡的湖羊背最長肌中的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，年齡對Myogenin 基因在湖羊背最長肌中的表達(dá)有顯著影響，且幼年的湖羊Myogenin 基因表達(dá)量最高。通過定量PCR 試驗(yàn)結(jié)果可以看出，Myogenin 基因在幼年時(shí)期表達(dá)量極高，與其他發(fā)育時(shí)期相比具有顯著差異。表明肌肉在幼年時(shí)期發(fā)育分化最快，與已有研究結(jié)果基本一致。小鼠骨骼肌Myogenin 的表達(dá)量與其發(fā)育時(shí)期密切相關(guān)，且在幼年時(shí)期表達(dá)量最高。

本研究結(jié)果表明，Myogenin 基因在幼年、性成熟、體成熟和老年時(shí)期4 個階段的小鼠骨骼肌中均有表達(dá)，且表達(dá)位置是細(xì)胞質(zhì)。Myogenin 基因在這4 個階段的表達(dá)量具有顯著差異，且在幼年時(shí)期小鼠骨骼肌的表達(dá)量極高，在性成熟時(shí)期小鼠骨骼肌中的表達(dá)量減少不明顯，而在體成熟期和老年時(shí)期小鼠骨骼肌中的表達(dá)量顯著減少。