豬流行性腹瀉與豬圓環(huán)病毒2 型混合感染的診斷與分析

韓陸嬋，薛翼鵬，趙 岳，孟 帆，樊振華，米瑞娟，吳 忻

（山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）是引起豬腹瀉的主要病毒性病原[1-2]。近幾年來，國內豬流行性腹瀉（PED）呈高發(fā)態(tài)勢，特別是某些豬場哺乳仔豬病死率高達100%，對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。PED 最主要的臨床癥狀為精神萎頓、被毛暗淡粗亂、身軀干枯、腹瀉嘔吐等，最終由于脫水導致仔豬很快死亡。所有日齡的豬均可感染發(fā)病，且仔豬的發(fā)病率高達100%[3]。PED 的發(fā)生存在明顯的季節(jié)性，多發(fā)生于寒冷的冬季與冬春交接月份[4]；尤其出生7 d 以內的仔豬最易感病，發(fā)病早的出生后3 d 整窩暴發(fā)腹瀉癥狀，3～4 d 后嚴重脫水導致死亡；3～4 周齡以上的仔豬在感染7～10 d 后可逐漸恢復；育肥豬及母豬感染后也有腹瀉表現，同時也會出現嗜睡和食欲不振等表現[5]，病程一般在20 d 以上。但規(guī)模養(yǎng)殖場仔豬生產批次較多，病程持續(xù)的時間可能還會延長[6]。

PED 于20 世紀70 年代英國首次報道，該病迅速蔓延至歐洲各國；在亞洲，1982 在日本年首次報道PED 的發(fā)生，并迅速傳播至我國、韓國等毗鄰國家并不斷發(fā)生流行，在20 世紀90 年代，由PED 引發(fā)仔豬的死亡率由30%上升至100%；2010 年以后，在我國南方一些省份大規(guī)模流行PED，并逐漸向內地及西北省份蔓延，據統(tǒng)計，至少有29 個省份存在PED 的暴發(fā)和流行；2013 年末，在韓國以及中國臺灣地區(qū)也有相關PED 暴發(fā)的報道[7]。而豬圓環(huán)病毒2 型（Porcine Circovirus type 2，PCV2）是我國目前豬感染率最高的疫病，可引發(fā)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS），其可造成免疫抑制，臨床上亦可表現腹瀉[1-2]。這2 種病混合感染，會導致病情加重，死亡率加大，給疫病的及時確診和防控帶來了難度。目前有報道指出，2 種病毒同時感染引發(fā)的疾病已經給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失[1，8]。

2015 年以來山西省多個地區(qū)規(guī)?；i場哺乳仔豬發(fā)生水樣腹瀉，最終脫水導致死亡，死亡率高達80%～100%，損失嚴重，到目前為止仍有豬場未得到控制。主要表現7 日齡內哺乳仔豬整窩暴發(fā)腹瀉、嘔吐、脫水等臨床癥狀，且死亡率極高；同時育肥豬以及成年母豬也出現腹瀉或精神沉郁。

山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所豬病研究室從各地規(guī)?；i場采集因腹瀉病死哺乳仔豬腸道內容物及腸系膜淋巴結各53 份，對其進行了分子學檢測診斷，旨在明確引發(fā)PED 的主要病原，并提出了相應的綜合防控措施，為PED 的有效防控提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集 嚴格按照動物疫病實驗室病料樣品采集方法的相關規(guī)定，對山西省5 個哺乳仔豬流行腹瀉的規(guī)?；i場采集病、死豬，實驗室無菌條件下將腸內容物及3 個不同位置的腸系膜淋巴結取樣53 份，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 PCR 試劑盒 豬圓環(huán)病毒PCR 檢測試劑盒和豬流行性腹瀉病毒RT-PCR 檢測試劑盒由北京世紀元亨提供。

1.2 方法

1.2.1 組織樣品處理 取腸系膜淋巴結約1 g，用手術剪剪碎后取0.05 g 于研磨器中加入PBS 緩沖液1.5 mL，研磨至勻漿后轉至1.5 mL 滅菌離心管中，以8 000 r/min 離心2 min，取上清液100 μL 移至1.5 mL 滅菌離心管中。

1.2.2 腸內容物樣品處理 取約0.05 g 腸內容物置于1.5 mL 滅菌離心管中，再加入PBS 緩沖液1 mL 振蕩30 s，以8 000 r/min 離心2 min，取上清液100 μL轉入1.5 mL 滅菌離心管中。

1.2.3 PEDV 檢測 將腸內容物樣品置于吸附柱中，以13 000 r/min 離心30 s。棄去收集管中離出液體，加入600 μL 洗液，重復離心2 次。棄去收集管中離出液體，13 000 r/min 空柱離心2 min，除去殘留的洗滌液。將吸附柱換入新的1.5 mL 離心管中，加入洗脫液50 μL，室溫靜置1 min，重復離心30 s，離心管中獲取PEDV 模板RNA。RT-PCR 擴增每份總體積20 μL，進行PCR 擴增：42 ℃45 min，95 ℃3 min；95 ℃30 s，53 ℃30 s，72 ℃40 s，共35 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 產物及其相應的陽性對照在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察被檢樣品出現651 bp 為陽性。

1.2.4 PCV2 檢測 將淋巴結樣品100 μL 移入1.5 mL滅菌離心管中，加入20 μL蛋白酶K 和200 μL消化液，振蕩30 s 混勻后，置56 ℃電浴器中消化60 min。降至室溫后，加入300 μLDNA 結合液，充分混勻，移入吸附柱中，室溫下靜置3 min，以10 000 r/min 離心30 s。棄去收集管中液體，加入500 μLDNA洗滌液，重復離心2 次。棄去液體，將吸附柱換入新的1.5 mL 離心管中，加入50 μL DNA 洗脫液，室溫下靜置2 min，再次離心30 s，獲得液體即為PCV2模板DNA。PCR 擴增每份總體積20 μL，進行PCR擴增：94 ℃3 min；94 ℃30 s，62 ℃45 s，72 ℃45 s，共35 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 產物及其相應的陽性對照在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察被檢樣品出現1 154 bp 擴增帶為PCV2陽性。

2 結果與分析

2.1 PEDV 檢測結果

電泳結果顯示，腸內容物樣品53 份中有48 份在651 bp 處出現陽性條帶，與PEDV 陽性對照出現條帶位置一致。樣品PEDV 陽性率為90.6%（圖1）。因此，可以判定山西省多地區(qū)規(guī)?；i場新生仔豬發(fā)生水樣腹瀉導致大批死亡的主要病原是PEDV，臨床癥狀表現與PED 一致。該病的主要傳染源是發(fā)病豬和帶毒豬，康復豬會持續(xù)帶毒，并不斷排出帶有PEDV 的糞便，污染環(huán)境和飼料；PEDV 的傳播途徑是通過口與鼻進入豬的體內[9]，除有效的疫苗預防外，也應搞好綜合防控措施。

2.2 PCV2 檢測結果

電泳結果顯示，在腸系膜淋巴結樣品53 份中有37 份在1 154 bp 處出現陽性條帶，與PCV2 陽性對照出現條帶位置一致。樣品PCV2 陽性率為69.8%（圖2）。本次發(fā)病豬群的臨床癥狀不僅表現為腹瀉，還有精神沉郁、行動遲緩、厭食、被毛蓬亂、皮膚蒼白、呼吸困難和以間斷性咳嗽為特征的呼吸癥候。說明在本次PED 的大面積流行是由PEDV與PCV2 混合感染引起的。所以，在預防PED 發(fā)生的同時，也應搞好PCV2 的預防工作。

3 結論與討論

本研究通過對腹瀉死亡仔豬腸道內容物及腸系膜淋巴結的檢測可以認定，本次山西省多地區(qū)規(guī)模化豬場大面積出現新生仔豬發(fā)生水樣腹瀉導致大批死亡的主要病原是PEDV，并且伴隨著PCV2 的混合感染。發(fā)病豬場通過對母豬和仔豬進行PEDV疫苗的免疫[10-11]，在產前30 d 對母豬加強免疫PCV2疫苗，并對豬舍及產房采取嚴格消毒、注意保溫與空氣流通、保證仔豬出生后6 h 之內吃到初乳等措施后，使豬群發(fā)病情況明顯下降。

2010 年以來，在我國南方一些省份大規(guī)模流行PED，并逐漸向國內其他省份蔓延，經研究證實，PEDV 流行株發(fā)生變異[12-14]，當前疫苗株不能提供良好的保護[7，12，15-16]。因此，PED 在山西省的嚴重發(fā)生與其在我國的流行具有很大關系[15]，不僅有病毒發(fā)生變異的原因，而且與PCV2 的協同感染致使豬群的發(fā)病率、死亡率增加有著很大的關系。PCV2 感染可引起豬的免疫抑制，從而使機體更易感染其他病原[17]，其與PEDV 等病毒以及細菌混合感染的情況多有報道[1，8]，可使豬群病死率大大提高。資料顯示，PCV2 的首次發(fā)現也在20 世紀90 年代，此時正是PED 在世界各國呈現高發(fā)病率、高死亡率的時期[1-2]。因此，在當時PED 流行高發(fā)可能與PCV2 在豬群中感染情況增加具有一定關系。本次檢測發(fā)現，7 日齡之內的哺乳豬PCV2 病原陽性率為69.8%，說明豬群存在早期感染或母乳中母源抗體水平低下，所以，豬群疫病防控過程中應當把PCV2的免疫防疫作為首要工作。在產前免疫PEDV 疫苗的同時，也應加強PCV2 疫苗的免疫，以免仔豬過早感染PCV2，引起免疫抑制和PED 的發(fā)生。同時，預防PCV2 的早期感染對提高生產性能和控制其他疫病繼發(fā)感染同樣具有非常重要的意義。