應用實時熒光定量PCR 法檢測仔豬腸道內(nèi)乳酸桿菌和雙歧桿菌

吳蘇君，羅惠娣，趙 娟

（山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

仔豬的死亡率占整個生長階段死亡率的85%左右[1]，其病因及治療研究已成為商業(yè)豬生產(chǎn)中一個新的研究熱點。有研究表明，仔豬死亡的一個主要病因為腹瀉。仔豬生長發(fā)育速度快，營養(yǎng)物質(zhì)代謝旺盛，但其消化道發(fā)育不完善，先天性免疫能力較低，其免疫功能和腸道微生物的平衡易遭到破壞，從而導致動物感染和腹瀉的發(fā)生率升高[2]。仔豬腸道中有很多種類的菌群，它們共同形成一個關系到宿主免疫、代謝及營養(yǎng)等多方面的微生態(tài)系統(tǒng)，影響著宿主健康[3]。研究發(fā)現(xiàn)，腹瀉仔豬會出現(xiàn)腸道菌群微生態(tài)平衡失調(diào)，進而推測其腹瀉的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)存在一定聯(lián)系。乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量作為反映機體腸道健康的“晴雨表”，研究其數(shù)量變化具有極其重要的指示意義。糞便作為宿主和腸道菌群的共代謝產(chǎn)物，很大程度上可反映腸道菌群狀態(tài)[3]。

本研究對1 月齡腹瀉仔豬及正常仔豬糞便中乳酸桿菌和雙歧桿菌進行定量分析，比較仔豬腸道內(nèi)這2 種細菌的數(shù)量，揭示其與腹瀉癥狀的聯(lián)系，為下一階段開展腸道菌群與疾病癥狀的相關性研究搭建平臺，為腸道菌群種類、數(shù)量變化的相關研究提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 研究對象 供試樣本取自山西省天祿豐種豬場。取1 月齡斷奶仔豬糞便，出現(xiàn)腹瀉癥狀組30 例，正常對照組30 例。糞便樣本用無菌管收集后置于-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 QIAamp DNA Stool Mini Kit 購自Qiagen 公司；TransStart Probe qPCR SuperMix 購自北京全式金公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自北京TIANGEN 公司等。

1.1.3 主要儀器 Rotor-Gene Q PCR 儀，德國QIAGEN 公司；2-16PK 型高速低溫離心機，Sigma（德國）公司；AL104-IC 電子天平，METTLER TOLEDO（上海）有限公司；1-14 型高速離心機，Eppendorf（德國）公司；MO6-063 摩爾基因型超純水機，上海摩勒生物科技有限公司；微量移液器，Eppenderf 公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ-LS-SⅡ型，上海博訊實業(yè)有限公司；101-2-BS-Ⅱ型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海聯(lián)進醫(yī)療器械廠；超低溫冰箱，中科美菱公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本DNA 提取 根據(jù)QIAamp DNA Stool Mini Kit 試劑盒中操作說明進行操作，提取樣本中糞便細菌基因組DNA，逐一檢測所提基因組濃度，樣本于-20 ℃冰箱儲存。

1.2.2 引物的設計與合成 在NCBI 中查找乳酸桿菌和雙歧桿菌16S rRNA 序列，使用軟件DNA MAN對比找出序列的同源性，進而發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌和雙歧桿菌的16S rRNA 基因保守區(qū)。依據(jù)其16S rRNA 特異性基因序列并參照國外文獻，利用引物設計軟件Primer Premier 6 設計乳酸桿菌和雙歧桿菌種屬特異性探針及引物，將設計出的引物通過NCBI 中BLAST 與基因庫內(nèi)其他序列比對，確定引物和探針序列具有特異性。探針及引物均由上海生工生物技術有限公司合成。實時熒光定量PCR 引物及探針序列如表1 所示。

表1 實時熒光定量PCR 引物及探針序列

1.2.3 標準曲線的制作 取正常對照組糞便基因組DNA 分別用乳酸桿菌和雙歧桿菌上下游引物進行擴增，切下擴增產(chǎn)物，依照DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒操作說明進行回收純化，分別測定回收產(chǎn)物的A 值（拷貝數(shù)/μL）及濃度，并分別換算為1 μL的標準品拷貝數(shù)來制作標準曲線。

1.2.4 實時熒光定量PCR 反應 取待測糞便樣品中提取的DNA 作為模板，進行乳酸桿菌和雙歧桿菌16S rDNA 實時熒光定量PCR 反應，試驗所用反應體系列于表2，試驗所用反應條件列于表3。試驗中使用ddH2O 代替DNA 模板作為陰性對照，同時進行標準品校正，由Rotor-Gene Q PCR 儀分析定量結(jié)果。

表2 實時熒光定量PCR 反應體系

表3 實時熒光定量PCR 反應條件

1.3 數(shù)據(jù)分析

樣本定量數(shù)據(jù)經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后以均值±標準差（x±s）表示，數(shù)據(jù)分析使用SPSS 21.0 軟件進行，用成組t 檢驗對兩組間進行比較，P≤0.05 為差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標準曲線

以不同拷貝數(shù)的標準品經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的拷貝數(shù)為橫坐標，以定量PCR 反應過程中達到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標，分別繪制2 種細菌的標準曲線，作為定量檢測的參照標準（圖1）。

2.2 實時熒光定量PCR 擴增分析

對正常對照組和出現(xiàn)腹瀉癥狀組糞便中的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量進行定量分析，Ct 值用于表示管內(nèi)熒光信號到達特定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（圖2）。

由圖2 可知，出現(xiàn)腹瀉癥狀組糞便中的乳酸桿菌和雙歧桿菌樣本本身所含的mRNA 的量少，即出現(xiàn)腹瀉癥狀組糞便中的乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量較正常對照組減少。

2.3 糞便細菌定量檢測結(jié)果

從表4 可以看出，出現(xiàn)腹瀉癥狀組糞便中的乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量明顯少于正常對照組（P＜0.05）。

表4 糞便標本細菌定量檢測結(jié)果 拷貝數(shù)/g

3 結(jié)論與討論

作為宿主體內(nèi)的腸道原籍菌群，它們作用非常重要：參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝過程、維護腸道上皮細胞健康、通過保護腸道黏膜來防御致病菌的侵害[4]以及利用菌體、代謝產(chǎn)物等激活免疫細胞、使得免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟，從而被認為是畜禽重要的代謝和免疫器官[5-6]。這些細菌與機體形成了一種共生關系，其相互間的數(shù)量、比例在一定范圍內(nèi)上下波動，但在健康畜禽體內(nèi)保持相對穩(wěn)定，呈現(xiàn)動態(tài)平衡。而這種平衡受到多種因素的影響，一旦腸道菌群的數(shù)量、種類失調(diào)，平衡關系被破壞，就會有相應的疾病發(fā)生、發(fā)展。乳酸桿菌和雙歧桿菌作為有益原籍菌群，在動物腸道內(nèi)廣泛定植，其通過分泌代謝產(chǎn)物、競爭排斥、形成保護膜抵抗病原微生物[7]、免疫調(diào)節(jié)等多種方式來發(fā)揮益生作用，以維持腸道微生物平衡及機體健康[8-9]，尤其對幼年畜禽，還可促進消化道發(fā)育成熟[10]，加快生長速度[11]。

據(jù)報道，我國約有80%的豬場中有仔豬表現(xiàn)出腹瀉的臨床癥狀，這一發(fā)病率達40%，腹瀉造成的死亡使集約化養(yǎng)豬行業(yè)蒙受極大的經(jīng)濟損失[12]。本試驗正是考慮到腹瀉對養(yǎng)豬業(yè)的影響，在查閱大量相關文獻后，計劃運用實時熒光定量PCR 技術來檢測腹瀉仔豬糞便中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量的變化[13]，以期發(fā)現(xiàn)腹瀉與這2 種原籍菌是否存在聯(lián)系。

本研究通過實時熒光定量PCR 法對仔豬腸道中的乳酸桿菌和雙歧桿菌進行定量分析，結(jié)果表明，腹瀉仔豬與健康仔豬相比，其糞便中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量顯著減少，表明仔豬腹瀉的發(fā)病可能與腸道菌群的數(shù)量改變相關。

MACK 等[14]研究表明，乳酸桿菌能通過改變腸道分泌的黏液成分及性狀來阻止病菌附著在腸壁上。尤其當抗原侵襲幼齡動物時，乳酸桿菌對于炎癥反應等免疫過程的發(fā)生非常重要[15]。DEITCH 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌在越過腸黏膜后，可刺激脾臟及其他器官中吞噬細胞的活性，激活免疫。WREN[17]研究表明，乳酸桿菌可以產(chǎn)生過氧化氫，抑制許多細菌的生長，進而減少仔豬腹瀉、雞白痢的發(fā)生率，提高動物生產(chǎn)性能。章文明[5]提出在仔豬飼養(yǎng)過程中，添加乳酸桿菌能有效預防仔豬腹瀉。TANABE等[18]研究表明，雙歧桿菌能通過抑制促炎因子IL-17在小鼠脾細胞中生成來緩解其腸道炎癥，減少腹瀉造成的損傷。邢爽等[19]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌還能促進腸道上皮細胞緊密連接蛋白的表達和合理分布，維持并改善上皮細胞的屏障功能。雙歧桿菌作為一種重要的益生菌，其在腸道內(nèi)的數(shù)量既可表示宿主腸道微生態(tài)平衡狀態(tài)，還可反映機體的健康狀況[20]。張吉鹍[21]研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌可將結(jié)合膽酸分解為抑菌殺菌功效更強的游離膽酸。DONG 等[22]研究指出，新生大鼠位于腸道中的雙歧桿菌可以促使該部位樹突狀細胞（DC）的成熟，并促進T 細胞在胸腺中的發(fā)育。劉國榮等[23]研究發(fā)現(xiàn)，當雙歧桿菌到達一定數(shù)量時，可以產(chǎn)生一種高效廣譜細菌素。因此，雙歧桿菌不單能提高免疫、抗衰老、抗腫瘤，還能合成多種維生素、細菌素，通過拮抗、抑制和營養(yǎng)等作用調(diào)整腸道菌群平衡，促進機體免疫機能[24]。這些研究表明，乳酸桿菌和雙歧桿菌作為動物腸道內(nèi)重要的原籍菌群，具有維持體內(nèi)微生態(tài)平衡、發(fā)揮生物拮抗、進行免疫調(diào)節(jié)、參與營養(yǎng)代謝等方面的作用，當其數(shù)量發(fā)生變化時，會使得動物機體內(nèi)原籍菌群數(shù)量和比例相應發(fā)生變化，動態(tài)平衡被破壞，從而導致機體的物質(zhì)代謝、營養(yǎng)轉(zhuǎn)化和合成發(fā)生障礙，可能引發(fā)動物腹瀉。這與本試驗的研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，腹瀉仔豬糞便中乳酸桿菌和雙歧桿菌的細菌數(shù)量明顯減少，表明腸道菌種及其數(shù)量與仔豬腹瀉的發(fā)病密切相關，提示喂飼乳酸桿菌和雙歧桿菌可能成為改善腸道菌群失調(diào)、維護腸屏障功能的新途徑，為仔豬腹瀉的微生態(tài)靶向治療提供一定的依據(jù)，但是需要今后在干預研究中進一步驗證。