非小細胞肺癌患者病理組織中MTH1的表達及臨床意義研究*

杜鳳華，閔旭紅，孔維博，孔祥舟，梅曉冬

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥 233001；2.安徽省胸科醫(yī)院放射介入科，合肥 233003)

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，發(fā)病率高且嚴重危及人類的健康[1]。隨著現(xiàn)代分子腫瘤學(xué)的進步，各種分子靶向治療取得了較大進步，但肺癌的預(yù)后仍然很差[2]，亟須尋找新的肺癌預(yù)后分子標志物和治療靶點。有學(xué)者認為癌癥的發(fā)生是細胞在各種內(nèi)外環(huán)境刺激下導(dǎo)致原癌基因和抑癌基因平衡失調(diào)、細胞增殖失控的過程[3]。氧化應(yīng)激、缺氧和表觀遺傳障礙在癌癥的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。呼吸、正常代謝和炎性反應(yīng)過程均產(chǎn)生活性氧(ROS)[4]，ROS可氧化核苷酸和蛋白質(zhì)，誘導(dǎo)基因突變和導(dǎo)致細胞衰老[5]。ROS可氧化核苷酸庫中的dGTP或直接氧化DNA中的鳥嘌呤堿基而產(chǎn)生8-氧代-鳥嘌呤(8-氧-G)。在DNA復(fù)制過程中，DNA聚合酶通常在模板DNA中插入8-氧代-dGTP，從而導(dǎo)致A到C或G到T的顛換突變[6]。

MutT同系物1(MutT homolog 1，MTH1)是一種氧化型嘌呤核苷三磷酸酶，將8-氧代-dGTP水解成其單磷酸形式，從而阻止DNA聚合酶將8-氧代-dGTP插入基因組[8]，對細胞基因組的穩(wěn)態(tài)起到保護作用。暴露于煙草煙霧或電離輻射，會增加正常細胞中的ROS水平[7]，這可能導(dǎo)致核苷酸庫中的8-氧-G積累。DNA中8-氧-G的過度積累可誘導(dǎo)細胞凋亡，因此癌細胞可能獲得防止DNA中8-氧-G積累機制。事實上，MTH1在腦癌、乳腺癌和胃癌中表現(xiàn)豐富[8-9]。動物實驗提示：MTH1是癌細胞增殖必需的酶，靶向MTH1可抑制由腫瘤細胞系發(fā)展而來的腫瘤的增殖[10-11]。這些發(fā)現(xiàn)提示MTH1在癌癥發(fā)展中起重要作用。盡管如此，MTH1在非小細胞肺癌(NSCLC)中的表達情況和臨床意義尚不清楚。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測197例NSCLC患者中MTH1蛋白的表達，探討MTH1表達與患者臨床病理因素和生存期之間的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年3月至2013年3月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院收治的可手術(shù)切除的NSCLC患者205例，均接受外科手術(shù)治療。納入標準：(1)年齡大于18歲，病理診斷為NSCLC；(2)術(shù)前未接受放化療。排除標準：(1)患者缺乏足夠的腫瘤組織；(2)術(shù)后診斷為小細胞肺癌；(3)術(shù)后的隨訪資料不完整。最終納入研究197例，對全部病理標準重新評估，TNM分類第8版用于病理分期[12]。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集 從患者的病歷資料中提取年齡、性別、吸煙史、BMI、輔助治療、病理診斷、間質(zhì)性肺炎和表皮生長因子受體(EGFR)突變等臨床病理信息。

1.2.2隨訪 患者手術(shù)后即開始隨訪，術(shù)后的前3年每隔6個月行1次胸部CT和血液腫瘤標志物檢查，以后每年進行1次胸部CT檢查，對懷疑復(fù)發(fā)的患者，采用PET檢查或病理活檢確診。

1.2.3病理組織MTH1的免疫組織化學(xué) 病理組織切片脫蠟后，用過氧化物酶封閉劑(080-01186 Wako，日本)和蛋白封閉劑(19-2410-3 Sigma-Aldrich，美國)處理標本。將組織切片與抗MTH1抗體(1∶100的稀釋度，兔抗人MTH1抗體，Sigma-Aldrich，美國)溫育。然后與DAKO ENVISION+聚合物/辣根過氧化物酶(HRP，抗兔;K4003 Dako，Tokyo，日本)溫育。液體DAB+發(fā)色團(049-22831，Wako，Osaka，日本)用于顯現(xiàn)抗原。用蘇木素對組織標本進行復(fù)染以區(qū)分細胞核和細胞質(zhì)。

1.2.4MTH1免疫組織化學(xué)評分和患者分組 兩位獨立的病理學(xué)家評估免疫組織化學(xué)的結(jié)果，根據(jù)MTH1染色細胞占總癌細胞比例確定評分[18]：1分，0～<20%；2分，20%～<40%；3分，40%～<60%；4分，60%～<80%；5分，80%～100%。同時，本研究根據(jù)MTH1染色評分進行受試者工作曲線分析其預(yù)測患者總生存率和無瘤生存率，ROC曲線提示最佳截斷值為3.234和3.443，將MTH1表達截止值設(shè)定為3分。<60%的腫瘤細胞染色評定為MTH1高表達組；≥60%的腫瘤細胞染色評定為MTH1低表達組。

2 結(jié) 果

2.1全部患者的臨床特征和MTH1表達情況 全組患者197例，其中男120例(60.9%)，女77例(39.1%)，中位年齡54(38，83)歲。104例(52.8%)患者吸煙史大于20包/年。腺癌140例(71.1%)，鱗癌42例(21.3%)，其他類型15例(7.6%)。在74例腫瘤中評估EGFR突變狀態(tài)，24例(32.4%)患者存在EGFR突變，見表1。MTH1主要在肺癌細胞的細胞核中表達，細胞質(zhì)中無表達，正常的肺組織細胞存在少許表達，見圖1。其中MTH1高表達組111例(56.3%)，低表達組86例(43.7%)。

2.2MTH1表達與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 MTH1高表達和男性、吸煙大于20包/年、鱗癌、病理分期大于Ⅰ期、腫瘤直徑大于3 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜浸潤陽性、淋巴管浸潤和血管浸潤顯著性相關(guān)(P<0.05)。在評估EGFR突變狀態(tài)的74例患者中，野生型EGFR傾向于與MTH1高表達相關(guān)(P<0.05),見表1。

A:MTH1高表達組；B:MTH1低表達組

圖1NSCLC癌組織免疫組織化學(xué)染色(100×)

表1 MTH1高表達和低表達組與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系[n(%)]

a：n=74

2.3MTH1高、低表達組總生存率及無瘤生存率之間關(guān)系 Kaplan-Meier曲線的生存分析顯示，MTH1高表達組預(yù)后顯著性低于MTH1低表達組。MTH1高表達組和MTH1低表達組5年總生存率分別為81.6%和92.3%(P=0.001 1)，5年無瘤生存率分別為55.0%和83.7%(P=0.000 2)，見圖2。

圖2 MTH1高低表達患者的總生存率和無瘤生存率的比較

圖3 肺腺癌MTH1高、低表達組的總生存率和無瘤生存率比較

2.4肺腺癌和肺鱗癌MTH1表達與總生存率及無瘤生存率的關(guān)系 肺腺癌患者MTH1高、低表達組5年總生存率分別為76.5%和95.4%(P=0.003 1)，無瘤生存率分別為55.3%和85.3%(P=0.000 7)。MTH1表達對肺鱗癌患者的總生存率及無瘤生存率無顯著影響,見圖3、4。

圖4 肺鱗癌MTH1高、低表達組的總生存率和無瘤生存率比較

2.5患者總存率的單因素和多因素分析 單因素分析顯示：MTH1與病理分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜浸潤、淋巴管浸潤和血管浸潤一起構(gòu)成總生存率的顯著性危險因素；而多因素分析提示：MTH1表達(HR=1.713,95%CI:1.865～4.118,P=0.047 0)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=9.190,95%CI:2.824～39.457,P<0.01)是患者總生存率的獨立危險因素，見表2。

2.6患者無瘤生存率的單因素和多因素分析 單因素分析顯示：MTH1與性別、吸煙程度、病理分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜浸潤、淋巴管浸潤和血管浸潤一起構(gòu)成總生存率的顯著性危險因素；而多因素分析提示：MTH1表達(HR=1.605，95%CI：1.627～3.248,P=0.039 0)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=4.502，95%CI：1.942～11.546,P=0.000 3)是患者無瘤生存率的獨立危險因素，見表3。

表2 總體生存率的單因素和多因素分析(n=197)

續(xù)表2 總體生存率的單因素和多因素分析(n=197)

表3 無瘤生存率的單因素和多因素分析(n=197)

續(xù)表3 無瘤生存率的單因素和多因素分析(n=197)

3 討 論

肺癌是病死率最高的癌癥，對人類的健康和生命具有極大的威脅。在現(xiàn)代腫瘤分子生物學(xué)研究的證實下，發(fā)生癌癥的原因是多種因素共同作用、多種基因共同參與、多階段的經(jīng)歷最終發(fā)展而成的十分復(fù)雜的生物學(xué)的行為。究其根本，肺癌的發(fā)生和癌癥基因被激活及抑制癌癥的基因失去活性有重要的聯(lián)系，以上兩種因素會直接造成腫瘤細胞失去凋亡功能，進而通過多種調(diào)控機制和血管生成因子的互相作用，進一步促使癌癥的發(fā)生。而血管內(nèi)皮細胞生長因子是目前所知的作用最強的促血管生長因子，能夠增強血管通透性，刺激血管內(nèi)皮細胞的產(chǎn)生，對內(nèi)皮細胞具有特意分裂能力。

NSCLC發(fā)病的機制為癌基因和抑癌基因失衡導(dǎo)致的細胞增殖失控，DNA精準復(fù)制過程是基因表達的基礎(chǔ)。內(nèi)外各種原因所致的DNA或DNA組成成分的損傷均可導(dǎo)致基因表達失控或細胞凋亡。

MTH1是一種氧化型嘌呤核苷三磷酸酶，將8-氧代-dGTP水解成其單磷酸形式，通過清除核苷酸庫中的氧化核苷酸來維持體細胞中遺傳信息完整性，防止細胞在復(fù)制過程中將8-氧-G摻入DNA和8-氧-G在細胞核中過度累積而導(dǎo)致細胞壞死。癌細胞常暴露于比周圍正常細胞更高的氧化應(yīng)激水平，并且MTH1在癌細胞中高表達，通過阻止氧化的dNTPs摻入DNA[10]，表明MTH1有助于癌細胞增殖[8]。MTH1活性對癌細胞完整性是必需的[10]。在NSCLC中，MTH1 mRNA過度表達，并與細胞8-氧-G水平呈負相關(guān)。有研究報道NSCLC組織中MTH1活性高于正常肺組織。然而，NSCLC中MTH1蛋白升高的臨床意義尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)MTH1蛋白高表達與NSCLC患者的腫瘤惡性潛能(淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期晚期)有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)與先前評估腎細胞癌中MTH1 mRNA表達的臨床報道一致。本研究還發(fā)現(xiàn)MTH1高表達患者的無瘤生存率和總生存率均低于MTH1低表達的患者。此為首次發(fā)現(xiàn)MTH1高表達和NSCLC生存期相關(guān)。多因素分析顯示MTH1高表達是患者無瘤生存率和總生存率的獨立的預(yù)后因子。這個研究結(jié)果提示腫瘤細胞增殖可能與需要MTH1的表達來對抗ROS所致的細胞DNA損傷有關(guān)。

MTH1如何影響NSCLC的生物學(xué)行為的精確機制尚不清楚。綜合文獻報道和本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MTH1表達增加NSCLC患者癌細胞的惡性潛能。在NSCLC的癌細胞中，具有高侵襲性的腫瘤細胞可能較多地暴露在ROS刺激下，誘導(dǎo)MTH1高表達，修復(fù)DNA，行快速增殖，使得腫瘤細胞更具有向淋巴管、血管浸潤和胸膜浸潤的潛能。癌細胞代謝研究提示：高侵襲性和進行性增殖癌細胞依賴于有氧糖酵解，實現(xiàn)DNA快速復(fù)制,分裂成子細胞并傳播到身體其他部位。這表明癌細胞中產(chǎn)生更多的氧化應(yīng)激[7]和ROS，導(dǎo)致更多的8-氧-G累積，導(dǎo)致癌細胞的壞死。事實上，癌細胞可能通過MTH1表達的增加逃避ROS所致的DNA損傷，從而表現(xiàn)出更高的惡性潛能。從而導(dǎo)致患者的預(yù)后更差。本研究顯示MTH1高表達與重度吸煙(>20包/年)顯著性相關(guān)，吸煙則是氧化應(yīng)激的觸發(fā)因素，吸煙量顯著性增加肺組織中ROS的水平。結(jié)合本研究的發(fā)現(xiàn)，提示吸煙患者肺癌的癌細胞惡性潛能更高，能應(yīng)對過度的氧化應(yīng)激。高氧化應(yīng)激環(huán)境中的癌細胞可能通過提高MTH1的表達而防止DNA中8-氧-G的累積。因此，MTH1可能是癌細胞氧化應(yīng)激的標志物，也是肺癌患者生存期較差的指標。

在肺癌的治療中，手術(shù)、放療和化療被認為是標準治療，但是對部分患者預(yù)后仍不理想，需要新的治療策略來延長NSCLC患者的預(yù)后。有研究顯示，阻斷MTH1有助于抑制細胞增殖[11,24]和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]，從而支持MTH1可作為NSCLC患者治療靶點。在本研究中，41%患者MTH1高表達，提示一些NSCLC患者可能會在未來的抑制MTH1的靶向治療中收益，其作為治療靶點的潛力尚需要進一步研究。

本研究有幾個局限性：(1)這是在單一機構(gòu)中進行的回顧性研究，尚需要多中心、大樣本量的研究驗證。(2)免疫組織化學(xué)結(jié)果的評估標準問題，盡管本研究通過ROC曲線尋找最佳的免疫組織化學(xué)評分的截斷值，尚需要建立統(tǒng)一的標準來評估MTH1的表達狀態(tài)來區(qū)分臨床上亞組。(3)腫瘤細胞中MTH1高表達的精確機制尚需進一步研究。

綜上所述，在NSCLC中，MTH1高表達患者表現(xiàn)出更高的惡性特征。MTH1高表達患者的無瘤生存率和總生存率低于MTH1低表達患者，同時MTH1表達是NSCLC預(yù)后的獨立危險因素。NSCLC患者術(shù)后病理MTH1表達狀態(tài)有助于區(qū)分預(yù)后較差的患者，其也可能成為NSCLC新的潛在治療靶點。