IL-1β和IGF-1在幼兔發(fā)育性髖脫位髖臼軟骨細胞中的表達和作用*

張?zhí)炀?俞 松,楊小紅,呂 欣,徐艷朋,羅 宇

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院小兒矯形外科，貴州遵義 563000)

發(fā)育性髖關(guān)節(jié)脫位(developmental dislocation of the hip，DDH)是小兒骨科常見的骨關(guān)節(jié)畸形之一，致殘率較高，治療不及時或未經(jīng)正確治療，易較早出現(xiàn)髖關(guān)節(jié)退行性變和骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)。研究發(fā)現(xiàn)，正常軟骨組織中軟骨細胞的增殖與凋亡及細胞外基質(zhì)的降解與合成之間處于一種動態(tài)平衡，當(dāng)這種平衡被打破后即可發(fā)生關(guān)節(jié)退行性變，目前DDH發(fā)生髖關(guān)節(jié)退行性變的機制仍不清楚，可能與髖臼軟骨細胞增殖和凋亡異常密切相關(guān)[1-2]。白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)在關(guān)節(jié)軟骨細胞的增殖、發(fā)育、成熟和凋亡過程中起重要作用，且兩者在軟骨細胞中的作用是相互拮抗的[3-4]。本實驗通過制作幼兔DDH動物模型，檢測不同時期髖臼軟骨細胞中IL-1β和IGF-1的表達情況，探討IL-1β和IGF-1在DDH髖臼軟骨細胞增殖和凋亡中的作用和意義，為兒童DDH退行性髖關(guān)節(jié)炎的預(yù)防和治療提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料 兔抗IL-1β多克隆抗體(bs-0812R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；兔抗IGF-1多克隆抗體(bs-0014R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L，ZB-2301，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色試劑盒(CW0125，北京康為世紀生物科技有限公司)；鼠抗GAPDH單克隆抗體(TA-08，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，濃度1/3 000)；蛋白垂直電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)[Chemi DocTMXRS+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及模型制作 4周齡實驗幼兔40只，雌雄不限，平均體質(zhì)量(0.45±0.06)kg；采用硫噴妥鈉肌肉注射麻醉，左側(cè)后肢伸膝屈髖位管型石膏固定，右側(cè)后肢不做特殊處理作為對照側(cè)。實驗8周后攝髖關(guān)節(jié)正位片了解造模情況，根據(jù)實驗側(cè)Shenton線不連續(xù)、髖臼指數(shù)增大和股骨頭位于Perkin方格外側(cè)象限判定為DDH造模成功[5]，造模不成功影響實驗進程需積極補充造模。選取造模成功的幼兔繼續(xù)進行實驗，分為A、B、C、D 4組，每組8只，分別在石膏固定8、12、16、20周后，采用空氣栓塞法處死，在無菌條件下解剖雙髖，將雙側(cè)髖臼邊緣軟骨塊分為兩部分，一部分迅速放入-80 ℃液氮保存，一部分放入10%中性甲醛液固定。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色檢測IL-1β和IGF-1的表達情況 用10%中性甲醛液固定標(biāo)本，然后行脫鈣、脫水、石蠟包埋、3～4 μm切片，常規(guī)脫蠟水化后，進行抗原修復(fù)，滴加3% H2O2消除組織內(nèi)源性過氧化物酶的活性，切片封閉后，逐步滴加IL-1β一抗(1∶200)或IGF-1一抗(1∶400)、4 ℃冰箱過夜，室溫下孵育45 min，滴加山羊抗兔IgG(H+L)二抗工作液和DAB顯色劑工作液，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片，鏡下觀察染色切片，軟骨細胞的細胞質(zhì)或細胞核被染成黃色或棕黃色為陽性，陰性對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗，并用目鏡網(wǎng)格測微尺隨機選擇6個視野(×400)進行觀察，記錄陽性細胞數(shù)量。陽性率用細胞分數(shù)來表示，即6個視野內(nèi)陽性軟骨細胞數(shù)占軟骨細胞總數(shù)的比值×100%。

1.2.3Western blot法檢測IL-1β和IGF-1的蛋白水平 取出用液氮保存的標(biāo)本，取0.2 g組織放入研缽中充分研磨，加入500 μL的細胞裂解液研磨至勻漿無明顯顆粒，高速離心15 min，BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，取上清液移至新的EP管，提取等量蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜封閉，加入IL-1β或IGF-1一抗(1∶1 000)，4 ℃搖床過夜，37 ℃水浴復(fù)溫后加二抗(1∶1 000)，孵育后漂洗顯色，用GAPDH 做內(nèi)參重復(fù)上述步驟，用Quatity One軟件掃描各條帶灰度值后進行定量分析(目的蛋白相對水平計算公式：目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值)。

2 結(jié) 果

2.1幼兔DDH造模情況 幼兔在造模過程中肢體活動受限，進食減少，部分幼兔死亡，無關(guān)節(jié)感染及骨折并發(fā)癥發(fā)生，但經(jīng)過積極補充造模，未影響實驗正常進行。實驗過程中共造模成功32只，分成4組，每組8只。

A、C：IL-1β和IGF-1在DDH實驗側(cè)髖臼軟骨中的表達，細胞質(zhì)被染成黃色或淡黃色；B、D：IL-1β和IGF-1在DDH對照側(cè)髖臼軟骨中的表達，細胞質(zhì)未見明顯著色

圖1IL-1β和IGF-1在髖臼軟骨中表達(免疫組織化學(xué)，×400)

2.2免疫組織化學(xué)法檢測IL-1β和IGF-1在髖臼軟骨細胞中的表達 IL-1β和IGF-1在每組實驗側(cè)和對照側(cè)的髖臼軟骨細胞中均有不同程度的表達，軟骨細胞細胞質(zhì)被染成黃色或棕黃色。IL-1β在4組中實驗側(cè)髖臼軟骨中陽性率逐漸增高，B、C和D組實驗側(cè)和對照側(cè)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IGF-1在C組實驗側(cè)髖臼軟骨細胞中的陽性率最高，B、C組實驗側(cè)和對照側(cè)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1，表1、2。

表1 各組髖臼軟骨細胞中IL-1β陽性率的變化情況

表2 各組髖臼軟骨細胞中IGF-1陽性率的變化情況

2.3Western blot法檢測IL-1β和IGF-1在髖臼軟骨細胞中的表達水平 IL-1β在實驗側(cè)髖臼軟骨細胞中的表達水平逐漸增加，在D組中的水平最高，B、C、D組實驗側(cè)和對照側(cè)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IGF-1在B組實驗側(cè)髖臼軟骨細胞中的表達水平最高，B、C組實驗側(cè)和對照側(cè)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2，表3、4。

圖2 各組髖臼軟骨細胞中IL-1β和IGF-1蛋白水平Western blot表3 各組髖臼軟骨細胞中IL-1β的蛋白水平比較

組別實驗側(cè)對照側(cè)tPA組0.532±0.1630.491±0.1220.569>0.05B組0.725±0.1740.509±0.1712.504<0.05C組0.832±0.2040.512±0.1793.335<0.05D組0.906±0.3030.608±0.1682.433<0.05

表4 各組髖臼軟骨細胞中IGF-1的蛋白水平比較

3 討 論

DDH是一種兒童早期出現(xiàn)的髖關(guān)節(jié)發(fā)育異常性疾病，可能會隨著生長發(fā)育好轉(zhuǎn)或加重，若伴有不同程度的髖臼發(fā)育不良，易早期發(fā)生髖關(guān)節(jié)退行性變。軟骨細胞是關(guān)節(jié)軟骨中的惟一細胞類型，維持著軟骨細胞和細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，兒童髖臼軟骨細胞還有軟骨內(nèi)化骨，促進髖臼生長發(fā)育的作用。研究發(fā)現(xiàn)髖臼軟骨細胞的增殖與凋亡活性異常在DDH的發(fā)展過程中有著重要意義[1]，但具體機制仍不清楚。損傷性細胞因子IL-1β和合成性細胞因子IGF-1是軟骨細胞在增殖和凋亡過程中重要的細胞因子，對DDH髖臼軟骨細胞的增殖和凋亡也可能有著重要的調(diào)控作用。

IL-1β是一種主要的關(guān)節(jié)軟骨退變代謝調(diào)節(jié)因子，與軟骨破裂、基質(zhì)降解密切相關(guān)，可誘導(dǎo)軟骨細胞變性和衰老，對軟骨細胞凋亡起到重要的調(diào)控作用，是OA的主要病因之一[6-7]。IL-1分為IL-1α和IL-1β兩種類型，正常軟骨細胞可產(chǎn)生少量的IL-1β，當(dāng)其損傷后可大量合成和分泌大量的IL-1β，并刺激細胞膜上IL-1β受體表達增高，IL-1β與受體結(jié)合后將病變的信息傳送到細胞內(nèi)，從而影響了軟骨細胞的正常代謝活動，刺激軟骨細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，加速軟骨基質(zhì)中蛋白多糖及膠原蛋白的降解，抑制蛋白多糖和膠原蛋白的合成，促進軟骨細胞凋亡的發(fā)生[8-9]。將 IL-1β加入到培養(yǎng)的軟骨細胞中，誘發(fā)型一氧化氮合酶(iNOS)水平顯著增高，一氧化氮合成、釋放增加，誘發(fā)關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡[10]；實驗表明OA患者的關(guān)節(jié)軟骨中IL-1β有較高水平的表達[11]。在本實驗幼兔DDH動物模型中，免疫組織化學(xué)法和Western blot法檢測結(jié)果均提示實驗側(cè)髖臼軟骨中IL-1β的水平高于對照組，且隨著脫位時間的延長，差異越顯著，這可能與DDH自然病程密切相關(guān)，即當(dāng)髖臼和股骨頭失去正常的解剖對位關(guān)系和生物力學(xué)刺激后，可導(dǎo)致了髖臼軟骨的損傷和退行性變，誘發(fā)和加速髖臼軟骨細胞的凋亡。本研究提示IL-1β可能是促進DDH髖臼軟骨細胞凋亡的原因之一。

IGF-1是一種具有胰島素樣合成代謝作用和促生長作用的多肽生長因子，促進軟骨細胞的增殖、表型的維持和軟骨細胞外基質(zhì)的合成，抑制各種原因誘導(dǎo)的軟骨細胞的凋亡[12]。IGF-1在青春期前可通過刺激軟骨細胞的增殖和塑形使骨骼呈線性生長，在成人通過刺激軟骨細胞合成基質(zhì)蛋白，抑制軟骨細胞的衰老和凋亡；IGF-1同樣也能抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡和對抗IL-1β引起的炎性介質(zhì)MMP-13[13-14]，IGF-1還可聯(lián)合透明質(zhì)酸促進大鼠股骨關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)，延緩周圍軟骨的退變[15]。本實驗B、C組中實驗側(cè)髖臼軟骨細胞中IGF-1表達和蛋白水平都較高，可使髖臼軟骨細胞保持著較高的增殖活性，抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡，尚能維持髖臼軟骨細胞增殖和凋亡之間的動態(tài)平衡，但隨著DDH自然病程的延長，髖臼軟骨細胞的增殖能力逐漸減弱，即發(fā)生髖臼軟骨不可逆性的損傷，這和DDH自然病程基本一致，但具體機制仍需要進一步研究。IL-1β和IGF-1在DDH早、中期髖臼軟骨中都有較高的表達，但后期IGF-1的表達減弱，提示DDH髖臼軟骨細胞在早、中期表現(xiàn)出較強的增殖活性與異常增高的凋亡率，后期增殖活性明顯減弱，這與部分文獻報道基本一致[1-2]，IL-1β與IGF-1在DDH髖臼軟骨細胞中的表達異常，導(dǎo)致增殖活性和凋亡率之間失衡，可能是DDH發(fā)生髖關(guān)節(jié)退行性變的原因之一。

本實驗制作的幼兔DDH動物模型可模擬人類DDH的自然病程和髖關(guān)節(jié)的病理生理變化過程，若早期對DDH進行干預(yù)和治療，恢復(fù)髖關(guān)節(jié)的解剖關(guān)系及相應(yīng)的生物力學(xué)環(huán)境，可能會改變這一自然病程，延緩?fù)诵行泽y關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。若本課題組在治療DDH時再采用其他方式進行干預(yù)，調(diào)控髖臼軟骨中IL-1β和IGF-1的生物學(xué)活性，維持髖臼軟骨細胞增殖和凋亡活性的動態(tài)平衡，或許在一定程度上能延緩或減少髖關(guān)節(jié)退行性變的發(fā)生，而這需要進一步的實驗研究。