硝基呋喃類代謝物液質(zhì)新方法驗證技術(shù)報告

郭 睿 曹院章 王艷紅 許東保 唐艷榮 張宛婧

（北京市朝陽區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，北京 100018）

1 實驗室基本概況

2 方法原理

樣品經(jīng)鹽酸水解，2-硝基苯甲醛過夜衍生，調(diào)pH值7.4后，用乙酸乙酯提取，正己烷凈化。采用液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀定性檢測，采用穩(wěn)定同位素內(nèi)標法進行定量測定。

3 試劑和材料

（1）甲醇（液相色譜純）。

（2）乙腈（液相色譜純）。

（3）乙酸乙酯（液相色譜純）。

（4）乙腈飽和正己烷：量取正己烷80ml于100ml分液漏斗中，加入適量乙腈后，劇烈振蕩，待分配平衡后，棄去乙腈層即可。

（5）鹽酸（優(yōu)級純）。

（6）氫氧化鈉（分析純）。

（7）甲酸（液相色譜純）。

（8）2-硝基苯甲醛（2-NBA）。

（9）三水磷酸鉀（分析純）。

（10）乙酸銨（優(yōu)級純）。

（11）鹽酸溶液（0.2mol/L）：量取17ml濃鹽酸（3.5）用水定容至1000ml。

（12）氫氧化鈉溶液（2.0mol/L）：稱取80g氫氧化鈉（3.6）用水溶解，定容至1000ml。

（13）2-硝基苯甲醛溶液（0.1mol/L）：稱取1.5g的2-硝基苯甲醛（3.8），用甲醇溶解，定容至100ml?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

（14）磷酸鉀溶液（0.3mol/L）：稱取79.893g三水磷酸鉀（3.9）用水溶解，定容至1000ml。

（15）0.1%甲酸水溶液（含0.0005 mol/L乙酸銨）：準確量取1 ml甲醇（3.1）和稱取0.0386g乙酸銨（3.10）用水溶解，定容至1000ml。

（16）標準品：呋喃它酮代謝物AMOZ、呋喃西林代謝物SEM、呋喃妥因代謝物AHD、呋喃唑酮代謝物AOZ、同位素內(nèi)標D5-AMOZ、13C15N-SEM、13C3-AHD、D4-AOZ，純度均大于99.0%。

（17）標準儲備液（100mg/L）：準確稱取適量標準品（3.16）（精確至0.0001g），用乙腈（3.2）配制成1mg/ml標準儲備液。-18℃避光保存，有效期3個月。

（18）混合中間標準溶液（1mg/L）：準確移取標準儲備液（3.17）各1ml于100ml容量瓶中，用乙腈定容，4℃避光保存，有效期1個月。

（19）混合標準工作溶液（0.01mg/L）：準確移取標準儲備液（3.18）0.1ml于10ml容量瓶中，用乙腈定容，4℃避光保存，有效期1周。

（20）內(nèi)標儲備液（100mg/L）：準確稱取適量標準品（3.16）（精確至0.0001g），用乙腈（3.2）配制成1mg/ml標準儲備液。-18℃避光保存，有效期3個月。

（21）中間內(nèi)標標準溶液（1mg/L）：準確移取內(nèi)標儲備液（3.20）各1ml于100ml容量瓶中，用乙腈定容，4℃避光保存，有效期1個月。

（22）混合內(nèi)標標準溶液（0.01mg/L）：準確移取標準儲備液（3.21）0.1ml于10ml容量瓶中，用乙腈定容，4℃避光保存，有效期1周。

（23）0.2μm微孔濾膜，有機相。

（24）氮氣：純度≥99.999%。

4 儀器和設(shè)備

（1）高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：配有電噴霧（ESI）離子源。

表2 儀器使用情況登記表

（2）分析天平：感量0.01g、0.00001g。

（3）高速冷凍離心機：最大轉(zhuǎn)速13000r/min。

（4）電熱恒溫振蕩箱。

（5）pH計。

（6）旋渦混合器。

（7）平行蒸發(fā)儀。

（8）聚乙烯離心管：50ml。

（9）氮氣吹干儀。

5 樣品

5.1 樣品制備

畜禽肉樣、鮮活魚樣采集后選取無骨可食肌肉部分盡快勻質(zhì)處理，處理完成后，要置于-18℃冰箱內(nèi)避光保存。

5.2 樣品水解和衍生化

準確稱取2.00g樣品，加入10ml甲醇-水混合溶液（1+1），均質(zhì)1min，4000r/min離心5min，吸取上清液棄掉。殘留物中加入10ml鹽酸溶液（0.2mol/L），均質(zhì)器10000r/min均質(zhì)1min后，再加入100μl混合內(nèi)標標準溶液（3.22），2-硝基苯甲醛溶液（0.1mol/L）100μl，渦旋混勻30s后，振蕩30 min，置37℃恒溫水浴振蕩過夜（16h）反應(yīng)。

5.3 提取和凈化

上述衍生溶液放置至室溫，加入1ml的 0.3mol/L磷酸鉀溶液（3.14），用2.0mol/L氫氧化鈉溶液（3.12）調(diào)pH至約7.4，再加入10ml乙酸乙酯，振蕩10min后，10000r/min高速離心10min，收集乙酸乙酯層，殘留物用乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并乙酸乙酯，在40℃下用氮氣吹干，殘留物用0.1%甲酸水溶液（3.15）溶解，再用3ml乙腈飽和的正己烷（3.4）分兩次液液分配，去除脂肪，下層水相經(jīng)0.2μm針孔過濾器過濾后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

6 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：BEH C18柱，50 mm×2.1mm（i.d.），粒度1.7μm。

流動相：A相：0.1%甲酸水溶液（3.15）；B相：0.1%甲酸乙腈溶液。

梯度洗脫：0～7min，維持10% B；7～12min，4% A線性變化至60% A；12～12.1min，60% A線性變化至4% A；12.1～16min，維持4% A。

流速：0.4ml/min。

進樣量：10μl。

柱溫：35℃。

離子源：電噴霧ESI正離子。

掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM。

監(jiān)測離子對：

呋喃它酮代謝物AMOZm/z 335.1>100.1（定量離子），335.1>262.1；

呋喃西林代謝物SEM m/z 209.1>166.0（定量離子），209.1>192.0；

呋喃唑酮代謝物AOZ m/z 236.1>134.0（定量離子），236.1>104.0；

呋喃妥因代謝物AHD m/z 249.1>134.1（定量離子），249.1>104.1；

D5-AMOZm/z 340.1>296.1；13C15N-SEM m/z 212.1>168.0；

13C3-AHD m/z 252.0>134.0； D4-AOZ m/z 240.1>134.1。

7 驗證項目及結(jié)果

7.1 方法檢出限

方法中的定性離子的響應(yīng)值低于定量離子的響應(yīng)值，所以信噪比以定性離子的信噪比表示。四種硝基呋喃類代謝物中呋喃西林代謝物SEM的響應(yīng)值最低，所以方法檢出限以滿足SEM的3倍信噪比判定。

測定12個獨立樣液，濃度為10μg/kg，進樣量為10μl，得到四種物質(zhì)定性離子信噪比，按照國標要求（一般以3倍信噪比的濃度作為最低檢測濃度），通過信噪比指導(dǎo)進行稀釋，最終稀釋到1/50樣液濃度為0.2μg/kg時，進樣量為10μl，滿足SEM的3倍信噪比，得到四種物質(zhì)定性離子信噪比，本文僅以SEM為例，如表3：

7.2 校準曲線方程及線性范圍

配置0.1μg/kg - 40μg/kg系列濃度混合標準溶液，上機檢測，至少具備了6個標準點（包括0點），每個標準點獨立制備了3個進行隨機檢測，因為方法中只需要對定量離子進行線性測定，所以只驗證了四種物質(zhì)定量離子的線性范圍，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)r＞0.995，本文僅以相關(guān)系數(shù)最低的SEM為例，見表4：

表3

表4

表5

7.3 方法的精密度測試

采用高（20μg/kg）、中（2μg/kg）、低（0.5μg/kg）3個濃度的實際樣品，每個平行進樣6次以上，以峰面積分別計算平均值、標準偏差、相對標準偏差，本文僅以響應(yīng)值最低的SEM為例，檢測結(jié)果如表5～表7：

綜上所述，根據(jù)《GB/T 32465-2015 化學分析方法驗證確認和內(nèi)部質(zhì)量控制要求》中7.4.4中的表4判定，參照標準《GB/T 21311-2007 動物源性食品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》開展的檢測項目所有涉及的檢測物質(zhì)的精密度均符合規(guī)定，標準驗證成立。

表4 （續(xù)） GB/T 32465-2015

7.4 方法準確度測試

取豬肉（P）、魚肉（F）、羊肉（O）、雞肉（C）、牛肉（B）各11份2g空白樣品，先按照5.1對樣品進行洗滌，然后按三個水平，每個水平三個重復(fù)添加四種硝基呋喃類代謝物混合標準溶液，靜置30min后按照5.3所述方法進行水解衍生-提取-濃縮-凈化，上機檢測，本文中僅以豬肉（P）中四種硝基呋喃類代謝物準確度實驗結(jié)果為例，檢測結(jié)果如表8：

綜上所述，根據(jù)《NY/T 1896-2010 獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》中附錄D中的表D.2判定，參照標準《GB/T 21311-2007 動物源性食品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》開展的檢測項目所有涉及樣品種類中的檢測物質(zhì)的準確度均符合規(guī)定，說明該方法準確度良好，標準驗證成立。

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8 結(jié)論

表6

表7

表9 本方法測定結(jié)果與要求對比表

表8 豬肉（P）中四種硝基呋喃類代謝物準確度實驗結(jié)果

方法檢測低限（LOQ）、線性范圍、精密度和準確度均滿足國標要求，本實驗室可以正確運用和實施方法《GB/T 21311-2007動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法》。