苗藥酢漿草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

馬雪，吳瑩瑩，賀亞都，王廣成，潘潔，張寶，李勇軍#

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550004；4.貴州維康子帆藥業(yè)股份有限公司，貴陽 550004）

苗藥酢漿草（苗名Suaib mib mib）為酢漿草科植物酢漿草（Oxalis corniculataL.）的新鮮或干燥全草，始載于《本草綱目》，又名酸漿草、三葉酸、斑鳩酸，在我國主要分布于華北、華中、華南、江西、云南、四川等地，尤其在貴州資源豐富[1]。酢漿草收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中[2]，為貴州省苗族常用藥材，具有清熱解毒、消腫散疾、補(bǔ)肺瀉肝、健胃止咳、涼血化瘀等功效，在苗族民間常用于治療泄瀉、痢疾、黃疸、淋病、疥癬、痔疾、跌打損傷等癥[3-5]。現(xiàn)代藥理研究表明，酢漿草具有較好的抗炎、抗病毒、抑菌和抗氧化作用[6-9]?；瘜W(xué)研究方面，從酢漿草中分離得到的化合物有黃酮類、鞣質(zhì)類、植物甾醇類、酚類、糖苷類、脂肪酸類以及揮發(fā)油類等[10-15]。李勝華等[16]從酢漿草中分離得到了異牡荊苷，并通過對酢漿草的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析研究，發(fā)現(xiàn)異牡荊苷為其主要代表性黃酮類化合物。

目前，含有酢漿草藥材的主要制劑有泌淋膠囊、泌淋顆粒、泌淋清膠囊、婦炎消膠囊、六味傷復(fù)寧酊、腫痛舒噴霧劑、骨康膠囊等，應(yīng)用較廣。但在2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中，酢漿草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項下僅有性狀描述及薄層色譜鑒別試驗，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)簡單，且薄層色譜鑒別方法煩瑣，展開劑中的苯具有毒性，不能滿足中藥現(xiàn)代的質(zhì)量控制要求。而中藥的質(zhì)量又將直接影響中醫(yī)的臨床療效及用藥安全。為確保酢漿草藥材質(zhì)量，本研究將通過鑒別研究、浸出物及含量測定等，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供試驗依據(jù)，進(jìn)而為酢漿草藥材的質(zhì)量控制和進(jìn)一步深度開發(fā)該藥用資源提供參考。

1 材料

1.1 儀器

50i顯微鏡、DS-Fi2顯微成像系統(tǒng)（日本尼康公司）；REPROSTAR3薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；UltiMate 3000高效液相色譜儀（包括系統(tǒng)控制器、低壓梯度組件、溫控樣品室、LPG-3400SD輸液泵、SR-3000 Solvent Rack脫氣組件、WPS-3000SLANAL YTICAL自動進(jìn)樣器、TCC-3000SD柱溫箱、ΜV-VIS檢測器及Chromeleon色譜數(shù)據(jù)工作站）購自美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 藥品與試劑

12批酢漿草藥材收集自貴州、安徽、云南和河南4個省份，由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院標(biāo)本館龍慶德副教授鑒定其為O.corniculataL.的新鮮或干燥全草；酢漿草對照藥材（批號：181126）、異牡荊苷對照品（批號：170904，純度：98.47%）均購自成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司；薄層色譜硅膠G板（青島海洋化工有限公司，批號：20180115）；所有試劑均為分析純。酢漿草藥材來源見表1。

表1 酢漿草藥材來源Tab 1 Source of O.corniculata

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 顯微鑒別 通過對12批酢漿草藥材樣品的粉末進(jìn)行觀察和測量，其顯微鑒別特征總結(jié)如下：本品粉末呈灰褐色至黃褐色。非腺毛甚多，主要為單細(xì)胞，先端尖，壁厚，具疣狀突起；還可見另一種非腺毛，先端鈍圓，壁薄光滑。草酸鈣方晶在莖薄壁細(xì)胞中，呈方形，直徑3～20 μm。纖維紋孔明顯，壁厚，直徑5～32 μm。導(dǎo)管為螺紋導(dǎo)管、梯紋導(dǎo)管及具緣紋孔導(dǎo)管。表皮細(xì)胞呈多邊形或不規(guī)則形，排列緊密，可見橢圓形氣孔。酢漿草藥材粉末顯微鑒別圖見圖1。

圖1 酢漿草藥材粉末顯微鑒別圖Fig 1 Microscopic characteristics of O.corniculata powder

2.1.2 薄層色譜鑒別 取各批次酢漿草藥材樣品粉末（過二號篩）0.5 g，加甲醇10 mL，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz）處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取酢漿草對照藥材粉末0.5 g，同法制成對照藥材溶液。照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502法[17]進(jìn)行薄層色譜試驗。吸取上述溶液各5μL，分別點于硅膠G板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（波長365 nm）下檢視。結(jié)果，在供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點。酢漿草藥材的薄層色譜圖見圖2。

圖2 酢漿草藥材的薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatograms of O.corniculata

2.2 檢查

2.2.1 水分含量測定 精密稱取各批次酢漿草藥材粉末（過二號篩）約2 g，照2015年版《中國藥典》（四部）通則0832中第二法——烘干法[17]進(jìn)行水分測定，并計算樣品中含水量。結(jié)果，12批酢漿草水分含量在6.66%～12.13%之間，詳見表2。

表2 酢漿草藥材中水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇溶性浸出物含量測定結(jié)果（n＝3，%%）Tab 2 Results of content determination of moisture，total ash，acid insoluble ash and ethanol extract in O.corniculata（n＝3，%%）

2.2.2 總灰分和酸不溶性灰分含量測定 精密稱取各批次酢漿草藥材粉末（過二號篩）約3 g，照2015年版《中國藥典》（四部）通則2302中灰分測定法[17]測定樣品中總灰分及酸不溶性灰分含量。結(jié)果，12批酢漿草藥材中總灰分含量為9.16%～13.79%，酸不溶性灰分含量為1.58%～4.63%，詳見表2。

2.3 醇溶性浸出物含量測定

因酢漿草的醇提物中含有較高的黃酮類成分[18]。此外，民間亦用其泡酒，具有涼血消腫、解毒散瘀的功效，根據(jù)酢漿草的主要化學(xué)成分及使用習(xí)慣，選擇研究其醇溶性浸出物。分別取各批次酢漿草藥材粉末（過二號篩）約2.0 g，照2015年版《中國藥典》（四部）通則2201浸出物測定法項下熱浸法[17]進(jìn)行測定，采用乙醇為溶劑。結(jié)果，12批次酢漿草醇溶性浸出物含量在5.22%～15.79%之間，詳見表2。

2.4 異牡荊苷含量測定

2.4.1 供試品溶液的制備 取酢漿草藥材粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，精密加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻、濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 對照品溶液的制備 取異牡荊苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解，制成每1 mL含異牡荊苷0.521 9 mg的溶液，搖勻，即得對照品貯備液。精密量取對照品溶液貯備液適量，制備成質(zhì)量濃度為26.1 μg/mL的對照品溶液。

2.4.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱為Venusil XBP C18（L）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，V/V）；流速為1 mL/min；色譜柱溫為35℃；檢測波長為338 nm；進(jìn)樣量為10 μL。分別取“2.4.1”供試品溶液和“2.4.2”對照品溶液，按此色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果，各色譜峰分離良好，異牡荊苷與相鄰峰間的分離度＞1.5，理論板數(shù)以異牡荊苷計不低于5 000。高效液相色譜圖見圖3。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.4.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取對照品貯備液適量，置于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度分別為5.20、10.4、26.1、52.2、78.3 μg/mL的系列對照品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制工作曲線，進(jìn)行回歸處理，得到回歸方程為y＝573.18x－0.031 9（r＝0.999 0）。結(jié)果表明，異牡荊苷質(zhì)量濃度在5.20～78.3 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 耐用性試驗 取酢漿草藥材（批號：20160924）粉末1 g，精密稱定，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，分別考察在不同流動相比例[乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86，V/V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，V/V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（16∶84，V/V）]，不同pH溶液[乙腈-0.05%磷酸溶液（15∶85，V/V）、乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85，V/V）、乙腈-0.15%磷酸溶液（15∶85，V/V）]，不同色譜柱[（Puls C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Venusil XBP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Luna C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]，不同柱溫（35、35、38℃）以及不同儀器[UlMate 3000（雙三元）、UlMate3000、島津Prominence LC-20A]下系統(tǒng)的耐用性，每個條件分別測定3份樣品，記錄色譜圖并計算不同條件下酢漿草藥材樣品溶液中異牡荊苷的含量。結(jié)果顯示，在不同試驗條件下酢漿草藥材樣品溶液中異牡荊苷含量的RSD均＜2.0%（n＝9），表明該方法耐用性良好。

2.4.6 精密度試驗 （1）重復(fù)性試驗：分別取酢漿草藥材（批號：20160924）粉末0.5 、1、1.5 g，各3份，精密稱定，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，并計算不同質(zhì)量濃度的酢漿草藥材樣品溶液中異牡荊苷的含量。結(jié)果，3個不同質(zhì)量濃度樣品溶液中異牡荊苷的平均含量為0.037%（按干燥品計），RSD為1.3%（n＝9），表明該方法重復(fù)性良好。（2）中間精密度試驗：以不同的實驗人（2名），在不同時間按上述方法分別取酢漿草藥材（批號：20160924）粉末1 g，各3份，精密稱定，按“2.4.1”項下制備供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示，異牡荊苷峰面積的RSD為0.019%（n＝6），表明方法的中間精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：201609-24），分別在室溫放置0、1、2、4、8、24 h后，按“2.4.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果，異牡荊苷峰面積的RSD為0.50%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收率試驗 取已知含量的酢漿草藥材（批號：20160924）粉末0.5 g，精密稱定，共6份，按稱量樣品中被測定成分的本底含量值加入異牡荊苷對照品，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.4.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果，異牡荊苷的平均回收率為98.67%，RSD為0.74%（n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度良好?；厥章试囼灲Y(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果Tab 3 Results of recovery tests

2.4.9 樣品含量測定 分別取各批次酢漿草藥材粉末約1 g，精密稱定，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，然后按“2.4.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖并計算各批次酢漿草中異牡荊苷的含量。結(jié)果，12批酢漿草藥材中異牡荊苷含量在0.036%～0.144%之間，詳見表4。

表4 12批酢漿草中異牡荊苷含量測定結(jié)果（n＝3，%%）Tab 4 Results of content determination of isovitexin in 12 batches of O.corniculata（n＝3，%%）

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別方法的改進(jìn)

2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中苗藥酢漿草薄層色譜鑒別項下的供試品溶液制備方法為：“取本品粉末3 g，加水10 mL，用鹽酸調(diào)pH至2～3，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液用等量乙醚萃取，分取醚層，揮至約1 mL，作為供試品溶液。”該操作較為復(fù)雜，包括調(diào)節(jié)pH、加熱回流、萃取等步驟；且展開劑為苯-甲醇-醋酸（45∶8∶4，V/V/V），使用具有強(qiáng)毒性的試劑苯，且使用量較大。其次，對照藥材每次試驗需3 g樣品，購買的規(guī)格一般為1 g/瓶，從經(jīng)濟(jì)成本上考慮，該方法消耗較大。在本研究中，筆者將供試品溶液制備方法修改為：分別取供試品和對照藥材粉末各0.5 g，甲醇超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液，并以三氯甲烷-甲醇-甲酸（8∶1∶0.1，V/V/V）為展開劑。該方法具有操作簡便，避免使用強(qiáng)毒性試劑苯，節(jié)約成本等優(yōu)點，且所得薄層斑點清晰、分離度良好。

3.2 含量測定中供試品溶液制備方法的選擇

在含量測定試驗中，筆者對供試品溶液的提取方法（超聲提取、回流提取、索式提取）、提取溶劑（甲醇、75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇、25%乙醇）及提取時間（0.5、1、2、4 h）等進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，采用50%甲醇回流1 h為制備供試品溶液的最佳方法。

綜上所述，本研究通過薄層色譜鑒別、常規(guī)檢查、浸出物及含量測定等方法提升了2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載的酢漿草藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為苗藥酢漿草藥材的質(zhì)量控制提供了一定參考。