HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定血脂康膠囊中8個(gè)成分的含量Δ

李媛，孫鑫

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇淮安223003）

紅曲（Red yeast rice，RYR）為曲霉科真菌紅曲霉Monascus purpureusWent.的菌絲體寄生在粳米上而成的紅曲米，具有健脾消食、活血化瘀之功效[1]。血脂康膠囊是以紅曲為主要原料，經(jīng)過(guò)特殊工藝提煉制作而成的抗高血脂藥物[2]。血脂康膠囊能顯著降低患者血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）的水平，同時(shí)還能夠減少伴有血脂異常的冠心病患者的心血管事件的發(fā)生，安全性較高[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究結(jié)果表明，血脂康膠囊中的活性成分主要分為兩類(lèi)：一類(lèi)為以洛伐他汀、洛伐他汀羥基酸和美伐他汀等為代表的他汀類(lèi)化合物，另一類(lèi)為以大豆苷、染料木苷、黃豆黃素等為代表的異黃酮類(lèi)成分[2-4]。血脂康膠囊的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中[5]，其含量測(cè)定項(xiàng)僅以洛伐他汀為質(zhì)控成分。然而，現(xiàn)有研究顯示，血脂康膠囊中的其余他汀類(lèi)成分（洛伐他汀羥基酸和美伐他汀）以及異黃酮類(lèi)成分（大豆苷和染料木苷）在抗高血脂中也有重要的作用[4，6]。因此，僅控制血脂康膠囊中洛伐他汀的含量，很難全面反映其質(zhì)量，因而限制了其臨床應(yīng)用。目前對(duì)血脂康膠囊制劑的質(zhì)量控制研究也僅僅局限于洛伐他汀等他汀類(lèi)成分的定量分析[7-8]。為了較為全面地控制血脂康膠囊的質(zhì)量，有必要同時(shí)對(duì)血脂康膠囊中的他汀類(lèi)和異黃酮類(lèi)成分進(jìn)行定量分析。本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）-二極管陣列檢測(cè)器（DAD）法同時(shí)測(cè)定血脂康膠囊中8個(gè)活性成分，包括5個(gè)異黃酮類(lèi)成分（大豆苷元、大豆苷、黃豆黃素、染料木素和染料木苷）和3個(gè)他汀類(lèi)化合物（洛伐他汀、洛伐他汀羥基酸和美伐他?。┑暮俊２⒋朔椒ㄓ糜诜治霾煌蔚难的z囊，旨在為完善血脂康膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-2010A（HT）型HPLC儀，包括四元梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD、LC Solution色譜工作站（日本Shimadzu公司）；KH-500DB數(shù)控超聲波清洗器（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）；3K15高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Sigma公司）；BT25S十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

8批血脂康膠囊（北大維信生物科技有限公司，批號(hào)：170324、170420、170608、170903、171209、171222、180422、180603）；大豆苷元（批號(hào)：MUST-15041107，純度：98%）、大豆苷（批號(hào)：MUST-15062218，純度：98%）、黃豆黃素（批號(hào)：MUST-17041419，純度：98%）、染料木素（批號(hào)：MUST-17040532，純度：98%）、染料木苷（批號(hào)：MUST-17030620，純度：98%）、洛伐他?。ㄅ?hào)：MUST-16072803，純度：98%）、洛伐他汀羥基酸（批號(hào)：MUST-17041001，純度：98%）7個(gè)對(duì)照品均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；美伐他汀對(duì)照品（大連美侖生物科技有限公司，批號(hào)：170809，純度：96%）；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，超純水由本實(shí)驗(yàn)室EPED超純水系統(tǒng)制備。

8個(gè)對(duì)照品化合物的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 血脂康膠囊中8個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structures of 8 compounds in Xuezhikang capsules

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Hypersil Gold C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，5%B→10%B；3～8 min，10%B→20%B；8～20 min，20%B→34%B；20～28 min，34%B→43%B；28～40 min，43%B→65%B；40～52 min，65%B→90%B；52～55 min，90%B→100%B）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm（洛伐他汀、洛伐他汀羥基酸和美伐他?。?，256 nm（大豆苷元、大豆苷、黃豆黃素、染料木素和染料木苷）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀等對(duì)照品適量，置于同一10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，制成每1 mL含大豆苷0.250 2 mg、染料木苷0.150 9 mg、大豆苷元0.113 3 mg、黃豆黃素0.150 6 mg、染料木素0.180 4 mg、洛伐他汀羥基酸0.201 2 mg、美伐他汀0.166 3 mg、洛伐他汀0.250 8 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取血脂康膠囊10粒，除去膠囊殼，傾倒出內(nèi)容物，混勻并粉碎，過(guò)60目篩；精密稱(chēng)取膠囊粉末約0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，于13 000 r/min離心10 min后，取上清液10 μL進(jìn)樣分析。

2.3 系統(tǒng)適用性考察

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（批號(hào)：180603）各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在該色譜條件下，供試品溶液中的大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀色譜峰與其余組分色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)以洛伐他汀峰計(jì)不低于6 000。高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得線性混合對(duì)照品工作液。精密吸取上述對(duì)照品工作液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積，以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸。8個(gè)成分的線性關(guān)系結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積，分別以信噪比（S/N）為3和10時(shí)的各被測(cè)成分質(zhì)量濃度確定其檢測(cè)限和定量限。結(jié)果，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀的檢測(cè)限分別為0.25、0.13、0.45、0.12、0.21、0.24、0.12、0.15 μg/mL，定量限分別為0.84、0.36、1.29、0.41、0.65、0.78、0.33、0.50 μg/mL。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

表1 8個(gè)成分的線性關(guān)系結(jié)果Tab 1 Linear relationship of 8 components

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各成分的峰面積，計(jì)算各峰面積的RSD值。結(jié)果，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀峰面積的RSD分別為0.89%、2.37%、1.08%、1.54%、1.48%、0.49%、2.06%、1.19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下同一份供試品溶液（批號(hào)：180603）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24、48 h后，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積，計(jì)算各峰面積的RSD值。結(jié)果，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀峰面積的RSD分別為2.01%、1.03%、2.12%、2.89%、0.91%、2.18%、1.65%、1.19%（n＝6），表明血脂康膠囊供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取血脂康膠囊樣品（批號(hào)：180603）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備樣品，平行6份。將制備好的供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄目標(biāo)成分的峰面積并計(jì)算其在樣品中的含量。結(jié)果，樣品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀含量的平均值分別為0.029、0.34、0.26、0.032、0.063、12.98、2.69、0.063 mg/g，RSD分別為 1.64%、0.56%、1.12%、2.26%、2.08%、1.33%、2.95%、1.19%（n＝6），表明本方法重復(fù)性好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取血脂康膠囊內(nèi)容物（批號(hào)：180603）適量，共6份，每份約0.15 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并將供試品溶液于“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積并計(jì)算回收率?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

分別取8批血脂康膠囊樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，平行測(cè)定3次，記錄各成分的峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中各成分含量。結(jié)果，8個(gè)批次血脂康膠囊樣品中洛伐他汀含量最高，但他汀類(lèi)成分含量差異較大，尤其是洛伐他汀和洛伐他汀羥基酸；在異黃酮類(lèi)成分中大豆苷元含量較高。樣品含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 供試品制備方法的選擇

筆者在前期試驗(yàn)中考察了不同提取條件對(duì)血脂康膠囊樣品提取效率的影響。（1）不同的提取溶劑：分別比較了不同提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇、甲醇）對(duì)異黃酮類(lèi)和他汀類(lèi)成分含量測(cè)定的影響。發(fā)現(xiàn)以甲醇提取時(shí)，異黃酮類(lèi)和他汀類(lèi)目標(biāo)分析物的含量較高，因此最終選用甲醇為提取溶劑；（2）不同提取時(shí)間：比較了不同提取時(shí)間（30、45、60 min）對(duì)異黃酮類(lèi)和他汀類(lèi)成分的含量測(cè)定的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同成分的提取率在各提取時(shí)間內(nèi)并無(wú)明顯差異。考慮效率因素，選擇了30 min為超聲提取時(shí)間。綜上，最終選擇甲醇超聲30 min作為血脂康膠囊供試品溶液制備方法中的主要條件。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

筆者在前期試驗(yàn)中采用DAD在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)血脂康膠囊樣品中8個(gè)成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，他汀類(lèi)成分在230、237和246 nm波長(zhǎng)處有較大的紫外吸收，異黃酮類(lèi)成分在256和330 nm波長(zhǎng)處有最大紫外吸收。故參考文獻(xiàn)[9-10]選擇他汀類(lèi)成分的檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm，異黃酮類(lèi)成分的檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm。

3.3 流動(dòng)相的選擇

在前期試驗(yàn)中，筆者首先考察了乙腈-純水、甲醇-純水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)的分離效果。結(jié)果表明，采用乙腈-純水比甲醇-純水的分析時(shí)間短，且加入甲酸后不僅能改善峰形，還有較好的分離度。因此，最終選定乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，在該分析條件下，各分析物的分離度均大于1.5，且峰形均較好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of recovery test（n＝6）

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（mg/g，n＝3）

3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析

本次試驗(yàn)結(jié)果表明，8個(gè)批次的血脂康膠囊樣品中洛伐他汀的含量均符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部）標(biāo)準(zhǔn)（2.5 mg/粒）。但在8個(gè)批次的血脂康膠囊樣品中，他汀類(lèi)成分含量差異較大，尤其是洛伐他汀和洛伐他汀羥基酸；大豆苷元在異黃酮類(lèi)成分中含量較高。目標(biāo)成分在血脂康膠囊樣品中的含量從高到低依次是洛伐他?。韭宸ニ×u基酸＞大豆苷元＞染料木素＞美伐他汀＞黃豆黃素＞染料木苷＞大豆苷。

中藥由于其多成分、多靶點(diǎn)的作用模式，只檢測(cè)單一有效成分以監(jiān)控中藥制劑的質(zhì)量有明顯的局限性[11]。隨著分析儀器的發(fā)展，同時(shí)監(jiān)控中藥制劑中多個(gè)效應(yīng)成分已成為控制中藥制劑質(zhì)量的發(fā)展趨勢(shì)[12]。本試驗(yàn)建立了HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定血脂康膠囊中的大豆苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素、洛伐他汀羥基酸、美伐他汀和洛伐他汀的含量，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，且有良好的重復(fù)性，可為血脂康膠囊的質(zhì)量控制研究提供參考。后續(xù)筆者將收集更多廠家的血脂康膠囊樣品，采用所建立的分析方法對(duì)這些指標(biāo)成分進(jìn)行分析檢測(cè)，以期為完善血脂康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。