生姜對(duì)缺血性腦水腫大鼠腦組織Na+-K+-2Cl-聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1型的影響*

張留超，何雄文，牛美蘭

(1.黃河科技學(xué)院藥理教研室，河南 鄭州 450063； 2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004)

腦水腫是指水在腦組織細(xì)胞內(nèi)外的異常蓄積，是腦缺血損傷后常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是致殘、致死的重要原因[1]。缺血性腦水腫發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚，是國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)，其中，Na+-K+-2Cl-聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1型(Na+-K+-2Cl-combined transporter type 1，NKCC1)被認(rèn)為在缺血性腦水腫中有著關(guān)鍵作用。已有研究證實(shí)，大鼠腦缺血模型的星形膠質(zhì)細(xì)胞 NKCC1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平均會(huì)顯著上調(diào)；當(dāng)予以 NKCC1的特異性抑制劑后其表達(dá)下降，并且血-腦屏障損害及神經(jīng)毒性均會(huì)減輕[2-3]。生姜是姜科植物姜 (ZingiberofficinaleRosc.)的新鮮根莖。研究表明，生姜具有較強(qiáng)的抗氧化、清除自由基、抗缺氧和缺血再灌注損傷等作用[4-5]。然而，生姜是否能夠通過(guò)調(diào)控NKCC1的表達(dá)水平，減輕缺血性腦水腫癥狀，從而發(fā)揮對(duì)大鼠缺血性腦損傷的保護(hù)作用尚不明確。本研究通過(guò)線栓法構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型，通過(guò)病理學(xué)檢測(cè)和腦含水量測(cè)定，觀察生姜對(duì)MCAO腦缺血再灌注模型大鼠NKCC1的影響，探討生姜對(duì)大鼠缺血性腦水腫的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

SPF級(jí)6～8周齡雄性大鼠30只，體質(zhì)量約210 g，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，質(zhì)量許可證號(hào)為SCXK(蘇)2018-0001，以商業(yè)飼料為食，在無(wú)病原環(huán)境中飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)得到鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 藥品、試劑與儀器

生姜購(gòu)于河南省商丘市夏邑縣曹集鄉(xiāng)。參照文獻(xiàn)方法[6]將其洗凈去皮，切碎后按1∶1 (W/V) 加入蒸餾水，榨汁機(jī)壓榨，用3層紗布過(guò)濾后，4 000 r/min 離心15 min，取上清液(生藥含量1 g/mL)，避光儲(chǔ)存于4 ℃冰箱備用。臨用時(shí)用蒸餾水分別稀釋配成100，200，400 g/L 3種質(zhì)量分?jǐn)?shù)。兔抗NKCC1抗體(批號(hào)YS-17824R)和鼠抗β微管蛋白抗體(批號(hào)ANT-019 )，購(gòu)自艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；羊抗兔LgG(H+L)Alexa Fluor 594標(biāo)記二抗(批號(hào)111-585-003)，山羊抗小鼠IgG H&L (IRDye? 680RD)預(yù)吸附二抗(批號(hào)33218ES60)和羊抗兔IRDye? 680抗體(批號(hào)926-68071)，購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。其余試劑均由Sigma-Aldrich公司提供。

1.3 動(dòng)物分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型對(duì)照組，生姜高、中、低劑量組5組，每組6只。生姜高、中、低劑量組依次給予生姜10，20，40 μL/g，假手術(shù)組、模型對(duì)照組給予等容積生理鹽水10 μL/g。均灌胃給藥，1 d 1次，連續(xù) 5 d。

1.4 大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型的建立

末次灌胃 30 min 后，參照線栓法[7]建立模型。將直徑為 0.26 mm市售尼龍漁線剪成 6 cm 長(zhǎng)，消毒備用。以質(zhì)量分?jǐn)?shù) 100 g/L 水合氯醛3.5 μL/g 腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，沿頸正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈；結(jié)扎頸外動(dòng)脈，夾閉頸總動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈；自頸總與頸內(nèi)動(dòng)脈分岔口上端的頸總動(dòng)脈上剪口，插入備好的尼龍漁線進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈到達(dá)大腦中動(dòng)脈，插入的深度為 20～25 mm，遇到阻力時(shí)停止；固定線栓，縫合。造模 2 h后觀察大鼠行為。另設(shè)假手術(shù)組作為對(duì)照，制作步驟同手術(shù)組，但血管分離后不插線栓。缺血 2 h 后抽出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組，生姜高、中、低劑量組。按造模前給藥方法繼續(xù)給藥5 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 取 材

末次給藥后的第10天，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，然后脫頸椎處死各組大鼠，取腦。每組取3只大鼠的右側(cè)腦組織分裝于凍存管中，立即放入液氮凍存，隨后放-80 ℃ 冰箱凍存，供Western-Blot 檢測(cè)使用。另外3只大鼠右側(cè)腦組織采用40 g/L多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)法進(jìn)行脫水、透明、石蠟包埋，冠狀位切片，供組織病理學(xué)檢查和免疫熒光法檢測(cè)。

1.5.2 神經(jīng)功能評(píng)分

根據(jù)文獻(xiàn)[7]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損癥狀、活動(dòng)正常者計(jì)0分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪者計(jì)1分，爬行時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈者計(jì)2分，行走時(shí)身體向偏癱側(cè)傾倒者計(jì)3分，不能自發(fā)行走、意識(shí)喪失者計(jì)4分。

1.5.3 腦組織病理學(xué)檢查

石蠟切片常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇至ddH2O，蘇木素染色4 min，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸乙醇分色2 s，自來(lái)水洗后酸化伊紅復(fù)染2 min，水洗，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。

1.5.4 腦組織含水量

分離右側(cè)大腦半球，稱濕重后，再置于80 ℃烤箱中烤至恒重后，稱干重，計(jì)算腦組織含水量。含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5.5 NKCC1蛋白

采用Western-Blot法檢測(cè)NKCC1蛋白。取少量缺血皮質(zhì)，提取其總蛋白，對(duì)蛋白進(jìn)行定量，常規(guī)法進(jìn)行Western-Blot操作，以Image Studio Lite Ver 4.0分析圖像結(jié)果。β-Actin為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，生姜高、中劑量組神經(jīng)功能評(píng)分減少，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；生姜低劑量組較之差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

組 別n神經(jīng)功能評(píng)分/分假手術(shù)組60.00±0.00模型對(duì)照組63.04±0.18???生姜高劑量組62.56±0.16###生姜中劑量組62.69±0.12###生姜低劑量組62.98±0.21#

注：與假手術(shù)組對(duì)比，***P<0.01； 與模型對(duì)照組對(duì)比，#P>0.05， ###P<0.01。

2.2 各組大鼠腦組織病理學(xué)檢查對(duì)比

假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞正常、連接緊密、組織致密。模型對(duì)照組大鼠腦組織病理改變明顯，可見(jiàn)明顯的組織水腫，在缺血中心區(qū)域可見(jiàn)較多壞死組織，面積大，呈篩網(wǎng)狀。生姜各劑量組大鼠腦組織的病理學(xué)改變有所改善，其中高、中劑量組改善效果較為明顯。見(jiàn)圖1。

圖1各組大鼠腦組織病理學(xué)對(duì)比(HE染色，×400)

2.3 各組大鼠腦含水量對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組大鼠腦組織含水量增加，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，生姜高、中劑量組腦組織含水量均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)；生姜低劑量組較之差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

組 別n濕重/g干重/g水含量/%假手術(shù)組60.665±0.0240.146±0.00478.00±0.51 模型對(duì)照組60.716±0.0220.148±0.00679.37±0.33???生姜高劑量組60.684±0.0340.149±0.00478.21±0.58###生姜中劑量組60.690±0.0270.148±0.00478.45±0.95##生姜低劑量組60.702±0.0210.147±0.00379.03±0.56#

注：與假手術(shù)組對(duì)比，***P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比， #P>0.05，###P<0.05，###P<0.01。

2.4 各組大鼠腦組織NKCC1Western-Blot法檢查對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組和生姜各劑量組大鼠腦組織NKCC1蛋白表達(dá)水平升高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型對(duì)照組對(duì)比，生姜各劑量組的NKCC1蛋白表達(dá)均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與生姜低劑量組對(duì)比，高劑量組的NKCC1蛋白表達(dá)降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而中劑量組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

組 別nNKCC1/(g·L-1)假手術(shù)組60.250±0.045模型對(duì)照組61.022±0.077???生姜高劑量組60.544±0.088??? ###△△△生姜中劑量組60.753±0.099???###△生姜低劑量組60.845±0.107???###

注：與假手術(shù)組對(duì)比，***P<0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比，###P<0.01；與生姜低劑量組對(duì)比， △P>0.05，△△△P<0.01。

3 討 論

生姜具有良好的抗氧化活性，對(duì)缺血再灌注氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用[2-4]。本研究采用線栓法建立大鼠MCAO再灌注模型[6]，結(jié)果模型大鼠均出現(xiàn)對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展，向?qū)?cè)傾倒或轉(zhuǎn)圈等神經(jīng)損傷癥狀；此外，病理組織學(xué)檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組大鼠對(duì)比，MCAO再灌注模型大鼠腦組織病理改變明顯，表明大鼠神經(jīng)系統(tǒng)受到損傷，造模成功。與假手術(shù)組對(duì)比，生姜各劑量組大鼠腦組織病理改變有所減輕，神經(jīng)功能評(píng)分下降，提示生姜可以緩解缺血再灌注所致的神經(jīng)細(xì)胞損傷，具有一定的神經(jīng)保護(hù)功能。模型對(duì)照組腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組，生姜高、中劑量給藥能夠有效降低腦組織含水量，提示生姜能夠緩解腦組織水腫癥狀，這可能是生姜對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)機(jī)制之一。

腦水腫是腦缺血損傷后腦細(xì)胞死亡的主要原因之一。腦缺血后由于病理性刺激、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)異常[8-9]，細(xì)胞內(nèi)外離子濃度失衡，細(xì)胞滲透性改變，細(xì)胞發(fā)生腫脹，進(jìn)而引起細(xì)胞損傷[10]。NKCC1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在腦組織有廣泛表達(dá)，主要分布在微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的細(xì)胞膜上，調(diào)控Na+-K+-2Cl-的平衡，對(duì)維持血腦屏障通透性、保持星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)正常離子濃度，以及細(xì)胞容積的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)有重要作用[11]。腦缺血缺氧后，能量代謝障礙加重[12]，活性氧、細(xì)胞外高鉀和炎癥因子等因素均可上調(diào)NKCC1，進(jìn)一步導(dǎo)致Na+內(nèi)流增多，而水通過(guò)滲透壓差轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)。有研究[2-3]發(fā)現(xiàn)：大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞后，腦梗死灶周?chē)鶱KCC1的表達(dá)均明顯增加，腦水腫加重；抑制NKCC1的表達(dá)可以減輕腦梗死面積，同時(shí)降低腦缺血造成的腦水腫風(fēng)險(xiǎn)。 生姜可以抗氧化，減輕炎癥損傷[14-15]，并能夠緩解缺氧和腦缺血再灌注損傷，但是生姜是否能夠通過(guò)降低NKCC1的表達(dá)水平從而緩解缺血性腦水腫尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究通過(guò)線栓法建立MCAO再灌注大鼠模型，通過(guò)免疫熒光法和Western-Blot法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)：MCAO組大腦組織NKCC1蛋白的表達(dá)水平均明顯升高，而生姜高、中劑量均能有效降低NKCC1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)合神經(jīng)功能評(píng)分、病理學(xué)檢查和腦含水量的研究結(jié)果，認(rèn)為生姜可能通過(guò)降低NKCC1蛋白的表達(dá)水平，減輕腦水腫癥狀，發(fā)揮對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用。

總之， MCAO再灌注大鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙，腦組織出現(xiàn)明顯的梗死灶并伴有腦組織含水量升高，NKCC1蛋白表達(dá)水平均明顯升高。生姜高、中劑量能明顯改善MCAO大鼠神經(jīng)病學(xué)癥狀，顯著縮小腦梗死面積，降低腦組織含水量，降低NKCC1表達(dá)水平，提示生姜減輕腦組織水腫和神經(jīng)損害癥狀可能與抑制NKCC1的表達(dá)有關(guān)。