新型雙功能谷胱甘肽合成酶的真核和原核表達(dá)

李佳慧 ，楊芳芳 ，王珍 ，張賽南 ，王首鋒 ，3*

（1.浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，浙江杭州310058；2.綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江杭州310052；3.浙江省微生物生化與代謝工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310058）

谷胱甘肽是一種由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的活性三肽，分子式為C10H17O6SN，相對(duì)分子質(zhì)量為307.33，熔點(diǎn)為189～193℃。谷胱甘肽分別以還原性谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSG)形式存在，但在人體內(nèi)主要為前者。結(jié)構(gòu)決定功能，正是由于其側(cè)鏈上有一個(gè)活潑巰基，能夠在生物體內(nèi)參與許多氧化還原反應(yīng)，使得谷胱甘肽具有多種生理功能，因此其應(yīng)用領(lǐng)域也十分廣泛。

目前，生產(chǎn)谷胱甘肽的方法有溶劑提取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法以及酶法。在大多數(shù)細(xì)胞及革蘭氏陰性菌中，谷胱甘肽的合成分2步[1]：第1步，在γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(γ-GCS,大腸桿菌中由基因gshA編碼，在酵母中由GSHI編碼)的作用下，將L-谷氨酸與L-半胱氨酸合成谷氨酸半胱氨酸；第2步，在γ-谷胱甘肽合成酶(GS，大腸桿菌中由gshB編碼，在酵母中由GSHII編碼)的作用下，將谷氨酸半胱氨酸合成谷胱甘肽。然而，當(dāng)體內(nèi)GSH含量較高時(shí)，就會(huì)與γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶結(jié)合，從而降低了GSH的合成與積累。LIAO等[2]通過構(gòu)建同時(shí)含有g(shù)shA和gshB基因的重組大腸桿菌，經(jīng)過表達(dá)發(fā)現(xiàn)，GSH質(zhì)量濃度為34.8 mg·L-1，較之前有很大提高。LI等[3]采用2種方法合成谷胱甘肽，一種是在含3種氨基酸和葡萄糖（通過糖酵解提供ATP）的條件下表達(dá)酵母細(xì)胞，對(duì)其生成谷胱甘肽的過程不進(jìn)行人為干預(yù)；另一種是嚴(yán)格控制第1步反應(yīng)中生成的谷氨酸、半胱氨酸的產(chǎn)量，并加入能恰好消除反饋抑制過程的甘氨酸。結(jié)果表明，后者所產(chǎn)谷胱甘肽產(chǎn)量為前者的1.5倍左右。這些均說明谷胱甘肽生成過程中的反饋抑制是可以被降低甚至消除的。

近年來，在一些革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌中發(fā)現(xiàn)了一種依賴ATP，能催化谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸生成谷胱甘肽，同時(shí)具有谷氨酸、半胱氨酸合成酶與谷胱甘肽合成酶活性的新型酶，即新型雙功能谷胱甘肽合成酶GshF。這些細(xì)菌主要有Streptococcus agalatiae[4], Streptococcusthermophiles[3], Listeria monocycogenes[5],Pasteurella multocida[6]等。在后2種細(xì)菌中，GshF的活性同樣受到GSH的反饋抑制。目前，雖已將利用基因改造高產(chǎn)菌株與傳統(tǒng)兩步法結(jié)合進(jìn)行GSH工業(yè)化生產(chǎn)，但仍存在成本較高和反饋抑制等問題，因此，對(duì)新型雙功能谷胱甘肽合成酶的研究十分重要，其在未來GSH的工業(yè)化生產(chǎn)中具有良好的前景。

已有較多實(shí)驗(yàn)從Streptococcus thermophiles中克隆目的基因并構(gòu)建重組表達(dá)載體，且GshF表達(dá)量較兩步法高。劉曉冬[7]從Streptococcus agalatiae中克隆得到目的基因gshF后構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-gshFSA，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破胞等處理后測(cè)得酶活為0.127 5 U·mg-1。YANG等[8]也從Streptococcus thermophiles中擴(kuò)增目的基因gshF并構(gòu)建原核表達(dá)載體，然后用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。迄今，對(duì)新型雙功能谷胱甘肽合成酶的報(bào)道不多，現(xiàn)有報(bào)道中多見通過構(gòu)建原核表達(dá)載體對(duì)目的基因gshF進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇從Streptococcus agalatiae中克隆目的基因gshF，再分別將其構(gòu)建到畢赤酵母和大腸桿菌2種表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒，分別對(duì)這2種重組表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)及酶活測(cè)定，最后比較表達(dá)產(chǎn)物GshF的酶活大小，選擇最適宜且最高效的表達(dá)方式，為以后工業(yè)生產(chǎn)GSH奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與材料

無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalatiae)購(gòu)自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；畢赤酵母GS115，表達(dá)載體pPIC9K，質(zhì)粒pET-28a，大腸桿菌E.coil BL21為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基(g·L-1)：蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，瓊脂粉15(配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入)，使用前加入相應(yīng)的50 mg·L-1卡那霉素。YPD培養(yǎng)基(g·L-1)：酵母提取物 10，蛋白胨 20，葡萄糖 20，瓊脂粉20(配置固體培養(yǎng)基時(shí)加入)。MD培養(yǎng)基：1.34%酵母基本氮源，4×10-5%生物素，2%葡萄糖，1.5%瓊脂。BMGY培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol·L-1磷 酸 鉀 (pH 6.0)，1.34%YNB，4×10-5%生物素，1%丙三醇。BMMY培養(yǎng)基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol·L-1磷酸鉀(pH 6.0)，1.34%YNB，4×10-5%生 物素 ，0.5% 甲 醇 。Todd-Hewitt肉湯(THB）培養(yǎng)基(g·L-1)：牛肉粉 10，胰蛋白胨20，葡萄糖2，碳酸氫鈉2，氯化鈉2，磷酸氫二鈉0.4。

1.1.3 工具酶與試劑

高保真DNA聚合酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)、Taq DNA 聚合酶、SnaB I、Not I、Sal I限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自Axygen公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T4 DNA連接酶試劑盒、割膠純化試劑盒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；Bradford蛋白定量試劑盒購(gòu)自BIOMIGA公司。

谷胱甘肽還原型、二硫代雙硝基苯甲酸［5，5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid),DTNB］、丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺、G418硫酸鹽、考馬斯亮藍(lán)R-250、蛋白中分子量marker、50×TAE核酸電泳緩沖液購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司;測(cè)序與引物合成送至生工生物工程(上海)有限公司;試劑和混合溶液的配制方法均參考文獻(xiàn)[9]。

1.2方法

1.2.1 試驗(yàn)材料的準(zhǔn)備

將購(gòu)買的凍干標(biāo)準(zhǔn)無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalatiae)菌種進(jìn)行復(fù)蘇，全程均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。首先打開凍干菌株瓶并用蘸取75%酒精的棉球擦拭瓶口及瓶身；然后往里加入500 μL標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)溶液，混勻后用接種環(huán)挑菌液直接劃到THB平板上，37℃培養(yǎng)。

1.2.2 gshF基因克隆

根據(jù)TaKaRa公司的MiniBESTBacteriaGenomic DNAExtraction試劑盒，從無(wú)乳鏈球菌(Streptococcus agalatiae)中提取基因組DNA。

根據(jù)GenBank公布的新型雙功能谷胱甘肽合成酶基因序列(EFV98076)以及畢赤酵母和大腸桿菌表達(dá)載體上多克隆位點(diǎn)的特征，分別設(shè)計(jì)引物對(duì)F1/R1和 F2/R2(見表 1)。其中引物 F1含有 SnaB I酶切位點(diǎn)（下劃線部分），引物R1含有Not I酶切位點(diǎn)（下劃線部分）；引物F2含有Not I酶切位點(diǎn)（下劃線部分），引物R2含有Sal I酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。以提取的基因組DNA為模板，分別以F1/R1和F2/R2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增目的基因gshF。PCR 反 應(yīng) 體 系(50 μL)：TaKaRa PrimeSTAR Max Premix(2× )25 μL，正 反 向 引 物 (10 μmol·L-1)各0.5 μL，上述模板 1 μL，H2O 23 μL。

表1 引物Table 1 Primers

PCR擴(kuò)增程序如下：

隨后對(duì)PCR產(chǎn)物gshF進(jìn)行檢測(cè)與割膠回收。

1.2.3 表達(dá)載體pPIC9K-gshF與pET-gshF的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與檢測(cè)

本研究采用雙酶切的方法將目的基因克隆到表達(dá)載體上。由引物對(duì)F1、R1擴(kuò)增得到的目的基因gshF用限制性內(nèi)切酶SnaB I和Not I雙酶切處理后，連接到用相同酶處理的質(zhì)粒pPIC9K上，得到重組質(zhì)粒pPIC9K-gshF；將以F2、R2為引物擴(kuò)增得到的gshF用限制性內(nèi)切酶Sal I和Not I雙酶切后連接到經(jīng)同樣處理的pET-28a上，得到重組質(zhì)粒pET-gshF。分別熱擊轉(zhuǎn)化至提前制備好的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21后，在含100 μg·mL-1卡那霉素的平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

用Sal I限制性內(nèi)切酶線性化處理構(gòu)建好的pPIC9K-gshF與空載體pPIC9K，經(jīng)PCR產(chǎn)物純化后電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中。同時(shí)電轉(zhuǎn)空載體pPIC9K作陰性對(duì)照。

采用MD平板篩選His＋轉(zhuǎn)化子。將重組轉(zhuǎn)化子用高壓滅菌水洗，將其分別涂在含0.25，1.0，2.0，4.0 mg·mL-1G418的YPD平板上，進(jìn)行多拷貝重組菌株篩選[11]。

1.2.4 多拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定

分別從 0.25，1.0，2.0，4.0 mg·mL-1G418抗性的YPD平板上挑取單克隆于YPD培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)過夜，取200 μL離心棄上清。再用等體積無(wú)菌水洗3次后，取1 μL作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，最終從4.0 mg·mL-1G418抗性YPD平板上鑒定出陽(yáng)性單克隆。

陽(yáng)性重組載體pET-gshF可直接誘導(dǎo)表達(dá)。

1.2.5 重組酵母GS115/pPIC9K-gshF的誘導(dǎo)表達(dá)

將上述陽(yáng)性重組酵母接種于5 mL YPD液體培養(yǎng)基，30℃過夜震蕩培養(yǎng)。按1%接種量轉(zhuǎn)入100 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃，250 r·min-1，搖菌培養(yǎng)至OD(600 nm)＝2～6。室溫下3 000 r·min-1離心5 min后棄上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體至OD(600 nm)＝1后誘導(dǎo)表達(dá)蛋白GshF。期間，每12 h取5 mL培養(yǎng)液且補(bǔ)加無(wú)水甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為2%。96 h后，收集發(fā)酵液，同之前不同時(shí)段取出的菌液一起離心，條件為10 000 r·min-1，離心10 min。用三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)對(duì)上清液脫鹽處理后，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.6 重組大腸桿菌BL21-pET-gshF的誘導(dǎo)培養(yǎng)與破胞

從平板上挑單菌落于含有卡那霉素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r·min-1培養(yǎng)過夜，然后取1%培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至50 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，同條件培養(yǎng)1.5 h后，加入過濾除菌的IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，繼續(xù)同條件培養(yǎng)7 h后，12 000 r·min-1離心后收集菌體[9]。

用 20 mmol·L-1的 Tris-HCl(pH8.0)重 懸 菌體，5 000 r·min-1，離心 10 min，洗滌 3 次。最后將菌體重懸在 10 mL 20 mmol·L-1Tris-HCl(pH8.0)，在冰浴中對(duì)菌懸液進(jìn)行超聲破胞，破碎條件為：功率200 W，5 s脈沖，7 s停息，共 40次。最后 8 000 r·min-1離心25 min后去掉沉淀，收集粗酶液。

1.2.7 蛋白質(zhì)量的測(cè)定

采用Bradford方法和紫外分光光度法測(cè)定[11]。

1.2.8 重組酵母及大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物酶活性測(cè)定

由于新型雙功能谷胱甘肽合成酶可以催化谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸生成谷胱甘肽，谷胱甘肽可由DTNB［5，5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)］法測(cè)定，且在412 nm具有特征吸收值，因此，可以通過測(cè)定吸光值來表征GshF的酶活。酶活測(cè)定：采用1 mL反應(yīng) 體 系 ：0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，40 mmol·L-1Glu，20 mmol·L-1Cys，40 mmol·L-1Gly，100 μL GshF，20mmol·L-1MgCl2，40mmol·L-1ATP，反應(yīng)液在37℃水浴下反應(yīng)20 min，取出500 μL與等體積的20%TCA混勻，再在冰上放置30 min后，12 000 r·min-1離 心 10 min，收 集 上 清 測(cè) 定 GSH濃度[12-13]。

采用DTNB法測(cè)定谷胱甘肽含量。取上述反應(yīng)所得待測(cè)GSH 0.5 mL加入1.5 mL 0.15 mol·L-1的NaOH溶液中，搖勻，再加入3%甲醛溶液（消除Cys的干擾），搖勻并靜置2 min。取0.5 mL上述混合液并加入2.5 mL DTNB分析液，搖勻，25℃水浴保溫5 min。然后以水為空白對(duì)照，測(cè)定在波長(zhǎng)412 nm處的吸光值[14]（DTNB分析液由1體積0.01 mol·L-1DTNB 溶 液 加 100體 積 0.25 mol·L-1(pH 8.0)的Tris-HCl緩沖液配制而成）。從谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到對(duì)應(yīng)的GSH濃度，然后計(jì)算GshF酶活。

酶活力單位（U）定義為每分鐘產(chǎn)生1 nmol谷胱甘肽所需的GshF酶量，用體積比酶活(U·mL-1)來衡量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

gshF基因可編碼750個(gè)氨基酸，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為85 595.51，等電點(diǎn)為5.44。

2.2 gshF基因的克隆

以直接提取的Streptococcus agalatiae基因組DNA為模板，分別利用2對(duì)引物和PrimeSTAR Max Premix(2×)擴(kuò)增目的基因。1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)顯示，在2 200 bp左右有1目的條帶，與預(yù)期大小一致（見圖1）。將目的片段分別連接在質(zhì)粒pPIC9K和pET-28a上后送去測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增得到的gshF與報(bào)道的來源于Streptococcus agalatiae ATCC13813的同源性達(dá)100%。

2.3 表達(dá)載體pPIC9K-gshF和pET-gshF的構(gòu)建

將目的基因片段gshF分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后，連接到用相同限制酶酶切的質(zhì)粒pPIC9K和pET-28a上，連接產(chǎn)物再熱擊轉(zhuǎn)化入BL21。重組載體構(gòu)建完成后再用相應(yīng)的限制酶雙酶切，電泳檢測(cè)顯示，得到約2 200 bp大小的片段（見圖2），與預(yù)期值相符。

圖1 gshF基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of gshF gene 1：DL5000DNA 標(biāo)志物；2：gshF基因PCR產(chǎn)物（模板為F1/R1）；3：gshF基因PCR產(chǎn)物（模板為F2/R2）1：DL5000DNA marker；2：Amplified PCR product of gshF（F1/R1Primer）；3：Amplified PCR product（F2/R2Primer）

圖2 重組表達(dá)載體pPIC9K-gshF和pET-gshF菌落PCR陽(yáng)性鑒定Fig.2 The PCR positive identification of pPIC9K-gshF and pET-gshF

2.4 表達(dá)載體pPIC9K-gshF的轉(zhuǎn)化與篩選

在將pPIC9K-gshF電轉(zhuǎn)到GS115之前，先用Sal I對(duì)其線性化處理。電轉(zhuǎn)至GS115后，用MD平板篩選，結(jié)果如圖3所示。平板MD-SA為重組載體電轉(zhuǎn)至GS115后所得的重組子，平板MD-pPIC9K為陰性對(duì)照。MD-SA上的重組子再分別經(jīng)含不同濃度G418的YPD平板篩選，最后篩選出對(duì)4.0 mg·mL-1G418有抗性的多拷貝重組菌株（見圖3）。

圖3 重組酵母的G418抗性平板篩選Fig.3 Screening result of G418 resistant plates of recombinant yeast

2.5 重組酵母GS115/pPIC9K-gshF菌落PCR鑒定

用牙簽蘸取上述多拷貝單菌落，在10 μL無(wú)菌水中震蕩后，100℃加熱5 min，可直接將其作為模板。用F1、R1(見表1)為引物進(jìn)行PCR鑒定，如圖4所示，在2 200 bp處出現(xiàn)目的條帶。

圖4 重組gshF抗性酵母菌株菌落PCR陽(yáng)性鑒定結(jié)果Fig.4 Positive identification result of colony PCR of recombinant gshF resistant yeast strain

2.6 重組畢赤酵母甲醇誘導(dǎo)表達(dá)

從含4.0 mg·mL-1G418的YPD平板上挑取經(jīng)PCR鑒定的單菌落，根據(jù)Invitrogen公司Pichia expression kit表達(dá)說明書，重組菌株以2%甲醇、30℃誘導(dǎo)表達(dá)96 h，每12 h取樣并添加無(wú)水甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為2%。離心收集上清液，再經(jīng)TCA沉淀后，進(jìn)行SDS-PAGE分析?？捡R斯亮藍(lán)染色后檢測(cè)各發(fā)酵時(shí)間的蛋白表達(dá)量(見圖5)。從圖5可見，在12 h處表達(dá)量最高，且在約85 kDa處均有特異性條帶，與預(yù)期相對(duì)分子質(zhì)量大小相符。

圖5 發(fā)酵上清蛋白SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of fermentation supernatant protein

2.7 重組大腸桿菌IPTG誘導(dǎo)表達(dá)

從新鮮平板上挑取鑒定過的重組菌株BL21-pET-gshF于含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r·min-1培養(yǎng)過夜，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于新的含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.5 h，再加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)7 h。離心收集菌體，用20 mmol·L-1的 Tris-HCl(pH 8.0)重懸并對(duì)其超聲處理。經(jīng)SDS-PAGE電泳與考馬斯亮藍(lán)染色后，蛋白表達(dá)結(jié)果如圖6所示。

圖6 超聲破碎前后蛋白SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of protein before and after ultra-sonication

2.8 Bradford法測(cè)定蛋白含量

按表2所示在不同編號(hào)的試管中加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液、蒸餾水與Bradford染色液?；靹蚝箪o置10 min，測(cè)定各管溶液的OD595并以標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度和OD595為橫縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖7)，線性回歸方程為y＝0.089 1x，R2=0.966 2。

取GS115/pPIC9K-gshF發(fā)酵表達(dá)上清與BL21-pET-gshF誘導(dǎo)表達(dá)破壁上清各50 μL加入試管中，再加50 μL蒸餾水。隨后加入3 mL Bradford染色液，混勻，室溫放置10 min后用紫外分光光度儀測(cè)定595 nm處的吸光度。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。其中，GS115/pPIC9K-gshF發(fā)酵表達(dá)中上清蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.46 mg·mL-1，BL21-pET-gshF誘導(dǎo)表達(dá)破壁上清中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.46 mg·mL-1。

2.9 谷胱甘肽的檢測(cè)

精確配制濃度為 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 g·L-1的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.8節(jié)方法測(cè)定。以GSH濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的OD412值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所得谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示，線性回歸方程為 y＝1.081x，R2=0.953 5。

通過測(cè)定2種不同表達(dá)方式所得GshF酶催化生成的谷胱甘肽在412 nm處的吸光值來計(jì)算GshF的酶活，結(jié)果見表3。

表2 Bradfrod法測(cè)定蛋白所需標(biāo)準(zhǔn)品Table 2 Standards for Bradford

圖7 Bradford法測(cè)定蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 The standard curve of protein by Bradford

圖8 谷胱甘肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 The standard curve of GSH

表3 不同菌株發(fā)酵表達(dá)的GshF酶活分析Table 3 Analysis enzyme activity in different strains

3 討 論

GSH是一種具有多種生理功能的重要物質(zhì)，且市場(chǎng)需求量巨大，主要應(yīng)用在：(1)食品行業(yè)。在酒類中添加GSH可維持酒的風(fēng)味，在面包等中加入GSH可使其保持色澤，加入肉制品中則可維持肉制品的新鮮度等。(2)化妝品行業(yè)。利用GSH可清除氧自由基，具有抗氧化等功效，還可用來制備美白產(chǎn)品等。(3)醫(yī)藥行業(yè)?？梢种艸IV病毒，也可作為抗癌藥物等。GSH純品及其衍生品在全球的銷量預(yù)計(jì)超90億元[15]，因此，降低成本、減少產(chǎn)物抑制顯得十分重要。除了在原有兩步法生成GSH途徑上進(jìn)行優(yōu)化外，還可深入研究新型雙功能谷胱甘肽合成酶。

近年來，在某些菌中發(fā)現(xiàn)了一種同時(shí)具備GSH I和GSH II酶活性的新型雙功能谷胱甘肽合成酶，且GSH對(duì)其不具有反饋抑制作用。與傳統(tǒng)兩步法生成GSH相比，該方法簡(jiǎn)化了生產(chǎn)步驟、降低了成本。因此，新型雙功能谷胱甘肽合成酶在未來GSH的生產(chǎn)中具有非常好的前景。

常用的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌與畢赤酵母2種。這2種表達(dá)系統(tǒng)各有特點(diǎn)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)繁殖快、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、成本低、周期短、表達(dá)高的優(yōu)點(diǎn)，能在較短時(shí)間內(nèi)獲得表達(dá)產(chǎn)物，但常須對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行破胞與純化，且不具有翻譯后修飾功能。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是最有效的外源蛋白表達(dá)體系之一，該系統(tǒng)不但可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行加工修飾，使表達(dá)的重組蛋白更接近天然蛋白的構(gòu)象；而且還具有分泌功能，能夠?qū)⒈磉_(dá)產(chǎn)物直接分泌至胞外，減少后期純化的成本。其高密度發(fā)酵生長(zhǎng)的特性更適合蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)。

本實(shí)驗(yàn)從無(wú)乳鏈球菌Streptococcus agalatiae中克隆目的基因gshF，利用基因工程的手段構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-gshF與pET-gshF，然后分別轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115和大腸桿菌BL21中表達(dá)。比較2種不同表達(dá)方式所得的GshF酶活，發(fā)現(xiàn)GshF更適合在大腸桿菌中表達(dá)，且比酶活可達(dá)62.15 U·mL-1，而在畢赤酵母表達(dá)中的比酶活僅為14.15 U·mL-1。本實(shí)驗(yàn)和已有文獻(xiàn)的結(jié)果表明，gshF可在重組大腸桿菌載體中高效表達(dá)，但其在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)量較低，可能因無(wú)乳鏈球菌Streptococcus agalatiae為細(xì)菌，其來源的目的基因gshF更適合在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)，但在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的密碼子具有偏好性。

因此，在后續(xù)研究工作中，會(huì)對(duì)無(wú)乳鏈球菌gshF進(jìn)行更多分子生物學(xué)水平上的功能改造，如基因的密碼子優(yōu)化和利用體外定點(diǎn)突變的方法進(jìn)行基因的酶活改造，以及后續(xù)發(fā)酵條件的優(yōu)化，尤其是對(duì)畢赤酵母發(fā)酵的溫度、pH等條件的優(yōu)化。同時(shí)，還可以利用親和層析等方法對(duì)GshF進(jìn)行純化，用來合成GSH和測(cè)定其含量。所以，未來在GSH的工業(yè)化生產(chǎn)過程中要綜合考慮2種表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)劣，通過多角度優(yōu)化，降低成本，提高產(chǎn)量，以滿足市場(chǎng)需求。