離子交換固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量

宗婧婧 ，嚴(yán)忠雍 ，張小軍 *，李停停 ，高學(xué)慧

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316021；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山316021）

泰妙菌素(tiamulin，TML)[1]和沃尼妙林(valnemulin，VLM)[2]是截短側(cè)耳素類半合成的動物專用抗生素，均屬于雙萜類[3]，結(jié)構(gòu)中含有八元環(huán)、五元環(huán)上的羰基、C-11位上的羥基和C-14位上?；然鶊F(tuán)，見圖1。該類抗生素通過抑制菌體蛋白的合成對革蘭氏陽性菌及支原體起抗菌作用[4-6]，具有抗菌活性強(qiáng)、治療效果顯著、休藥期短和使用安全性高等特點(diǎn)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，濫用這2種抗生素會導(dǎo)致其在水產(chǎn)品中大量殘留，最終通過食物鏈危害人類健康[7-10]。我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，水產(chǎn)品安全是全民關(guān)注的重點(diǎn)。為了避免泰妙菌素和沃尼妙林等藥物殘留，保證水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，有必要建立一種水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的檢測方法。

圖1 泰妙菌素和沃尼妙林結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formula of tiamulin and valnemulin

泰妙菌素和沃尼妙林是弱堿性化合物，采用強(qiáng)陽離子固相萃取凈化技術(shù)，將其鎖定在強(qiáng)陽離子交換點(diǎn)，降低由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等成分引起的基質(zhì)效應(yīng)。這樣不僅避免了對目標(biāo)物定性的影響，還保證了方法的準(zhǔn)確性和高效性。目前，國內(nèi)外對這2種抗生素的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[11]、高效液相色譜法(HPLC)[12-15]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLCMS/MS)[16-20]等。氣相色譜法需要衍生化，步驟復(fù)雜，操作煩瑣；高效液相色譜法雖然操作簡便，但受基質(zhì)的影響較大，靈敏度低，檢測限高；而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[21-24]具有高效準(zhǔn)確、靈敏度高和檢出限低等優(yōu)點(diǎn)。目前，UPLCMS/MS法檢測泰妙菌素和沃尼妙林多以畜禽肉類為檢測源，對水產(chǎn)品的檢測較少，此方法的前處理步驟較為復(fù)雜，耗時較長。本研究采用強(qiáng)陽離子交換固相萃取柱凈化結(jié)合UPLC-MS/MS法，操作簡便、快速準(zhǔn)確，與已報(bào)道的方法相比，本方法前處理用時更短、檢出限低、靈敏度高，更適合日常大批量樣品的篩查檢測。經(jīng)綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)考察了色譜和質(zhì)譜條件，并優(yōu)化了前處理提取和凈化方法，建立了一種UPLC-MS/MS同時測定水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用草魚、鯽魚、對蝦和梭子蟹各10 kg，均購自浙江舟山市臨城水產(chǎn)批發(fā)市場。經(jīng)超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)檢測，樣品均不含泰妙菌素和沃尼妙林藥物殘留。

泰妙菌素(tiamulin)、沃尼妙林(valnemulin)和泰妙菌素內(nèi)標(biāo)(Tiamulin-13C4Fumarate)均購自美國Sigma公司；Oasis MCX(3 mL，60 mg)固相萃取柱購自美國Waters公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q高純水；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨和正己烷均為色譜純，氨水為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

ACQUITYTM型超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQS四極桿質(zhì)譜儀(配電噴霧離子源)、ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，美國 Waters公司；MS2漩渦混合器，德國IKA公司；Centrifuge 5810高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；N-EVAP112氮吹儀，美國Organomation公司；VisiprepTMDL固相萃取裝置，美國Supelco公司；超聲波清洗器SK8200GT，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取泰妙菌素和沃尼妙林標(biāo)準(zhǔn)品各5.0 mg(精確至0.1 mg)，用甲醇溶解并定容至50 mL，配置成 100 μg·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液各500 μL，用甲醇稀釋并定容至50 mL，在室溫下混勻配成1 μg·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。再準(zhǔn)確稱取泰妙菌素內(nèi)標(biāo)1 mg(精確至0.1 mg)，用甲醇溶解并定容至 50 mL，配置成 20 μg·mL－1的泰妙菌素內(nèi)標(biāo)儲備液。

將上述標(biāo)準(zhǔn)溶液4℃避光冷藏保存，使用時分別用乙腈逐級稀釋成50 ng·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和100 ng·mL－1的泰妙菌素內(nèi)標(biāo)工作液，且現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品的提取與凈化

1.4.1 提取

準(zhǔn)確稱取充分勻質(zhì)的樣品2.00(±0.01)g置于50 mL離心管中，加入100 ng·mL－1的泰妙菌素內(nèi)標(biāo)工作液50 μL用10 mL乙腈提取，渦旋30 s，超聲10 min，7 000 r·min－1離心 5 min，最后將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，待凈化。

1.4.2 凈化

取3 mL甲醇活化Oasis MCX固相萃取柱(3 mL，60 mg)，2%甲酸-水溶液平衡。取上述乙腈提取液過柱，依次用2%甲酸水溶液、甲醇和正己烷各3 mL淋洗Oasis MCX固相萃取柱，待淋洗結(jié)束后，將柱內(nèi)殘留液抽干，最后用3 mL7%氨水-甲醇洗脫液洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，在50℃水浴中氮?dú)獯蹈?。加? mL含0.05%甲酸的5 mmol·L－1乙酸銨-乙腈(v/v=4：1)復(fù)溶，渦旋混勻，經(jīng) 0.22 μm 有機(jī)相濾膜過濾后用UPLC-MS/MS檢測。

1.5 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；色譜柱溫度：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相 A 為含 0.05%甲酸的 5 mmol·L－1乙 酸 銨 水 溶 液 ，B 為 乙 腈 ；流 速 為 0.3 mL·min－1，梯度洗脫目標(biāo)物。梯度洗脫條件如表1所示。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.6 質(zhì)譜條件

泰妙菌素和沃尼妙林經(jīng)色譜柱分離，用質(zhì)譜檢測，選用電噴霧離子源正離子掃描(ESI+)，多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring，MRM)，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，離子源溫度為119℃，脫溶劑氣溫度為385℃，選擇高純氮?dú)庾鳛殄F孔氣和脫溶劑氣，流速分別控制在55 L·h－1和800 L·h－1。在此質(zhì)譜離子源條件下，泰妙菌素和沃尼妙林的質(zhì)譜分析參數(shù)如表2所示。

表2 泰妙菌素和沃尼妙林的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of tiamulin and valnemulin

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取液和固相萃取柱的選擇

考慮實(shí)驗(yàn)水產(chǎn)品的含水率較高，樣品基質(zhì)成分復(fù)雜且較為分散，振蕩提取的方式易導(dǎo)致基質(zhì)分散黏壁造成目標(biāo)物損失，因此選用超聲提取方式。

為充分提取和凈化，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[25-27]的提取液和固相萃取柱(solid phase extraction column，SPE)方法，分別進(jìn)行乙腈和乙酸乙酯在MCX和HLB中的提取和凈化，并根據(jù)回收率分析提取效果，結(jié)果如圖2所示。由圖1知，乙腈和乙酸乙酯提取泰妙菌素的效果均較好，回收率均在97%以上，但用乙酸乙酯提取沃尼妙林的回收率較低。乙腈提取液能同時將2個待測物提取完全，回收率分別為103.33%和90.31%。而且在實(shí)驗(yàn)過程中，用Oasis HLB SPE柱凈化時，上樣體積的增加造成色素逐漸沉積，導(dǎo)致流速變慢甚至堵塞，前處理耗時長。Oasis MCX SPE柱可以縮短樣品前處理時間，提升凈化效果。綜合考慮，實(shí)驗(yàn)選用乙腈作為提取液，結(jié)合超聲提取的方式，用Oasis MCX SPE柱凈化。

2.1.2 提取次數(shù)的優(yōu)化

結(jié)合2.1.1節(jié)的結(jié)果，進(jìn)一步對比了10 mL乙腈提取1次和2次的區(qū)別。在草魚陰性樣本中加100 μL 50 ng·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測其回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，提取1次基本能將目標(biāo)物完全回收，回收率為92.21%，提取2次回收率為90.20%。這是由于2次提取液含水量不同，合并后溶液中有雜質(zhì)析出，溶液變渾濁，導(dǎo)致凈化時固相萃取MCX柱色素沉積甚至堵塞，回收率變低。因此，選擇用10 mL乙腈提取1次。

圖2 提取液和固相萃取柱對回收率的影響Fig.2 Effect of extract and solid phase extraction column on the recovery rate

2.1.3 洗脫液中氨水比例和洗脫體積的確定

考察了氨水-甲醇洗脫液中氨水比例和洗脫體積對回收率的影響。分別用1%，3%，5%，7%和9%的氨水-甲醇作為洗脫液，平均每mL取1次，共取4次，測其回收率。結(jié)果如圖3所示，氨水的比例為7%時，洗脫能力強(qiáng)，回收率最高，分別為96.34%和97.07%，洗脫體積為3 mL時，基本能將目標(biāo)物全部洗脫，隨著洗脫體積的增大，后期不僅無目標(biāo)物，而且會洗脫出其他雜質(zhì)，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,確定洗脫液為3 mL 7%氨水-甲醇。另外，考慮到水產(chǎn)品脂質(zhì)含量高，在淋洗時加入正己烷，防止乳化現(xiàn)象的發(fā)生。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

采用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)比采用常規(guī)液相色譜柱靈敏度更高，分析時間短，分離能力強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱 (50 mm×2.1 mm，1.7 μm)測 得 待 測 組 分 的 檢 出 限 為 0.03μg·kg－1，分析時間僅為5 min，結(jié)果基本不受基質(zhì)的影響，能夠在較短時間內(nèi)達(dá)到最有效的分離。

在流動相中加入一定量的有機(jī)酸，可以提高待測組分的分離度和離子化程度，因此，為使靈敏度和分離度達(dá)到最佳，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了甲酸在流動相中的比例。分別在流動相中加入不同比例的甲酸溶液，結(jié)果如圖4所示，以泰妙菌素為例，色譜圖a、b、c、d和e中甲酸的比例分別為0.02%，0.05%，0.1%，0.2%和0.5%，色譜圖c、d和e的響應(yīng)值為1.77×107～1.91×107，較圖a、b低，峰面積小而且有拖尾現(xiàn)象；色譜圖b較色譜圖a峰形尖銳，靈敏度和響應(yīng)值相對較高，因此實(shí)驗(yàn)將甲酸比例優(yōu)化為0.05%。

圖3 洗脫液中氨水比例和洗脫體積對回收率的影響Fig.3 Effect of ammonia ratio and elution volume on the recovery rate in eluent

圖4 不同體積分?jǐn)?shù)的甲酸溶液所測得待測組分的色譜圖Fig.4 Chromatograms of measured components in the sample by formic acid of different volume fraction

本實(shí)驗(yàn)選擇梯度洗脫的方式，與等度洗脫相比，梯度洗脫降低了溶液中雜峰對泰妙菌素和沃尼妙林峰形的影響，避免造成分析誤差，而且峰形尖銳，響應(yīng)值高。泰妙菌素和沃尼妙林的分析時間為5 min，保留時間分別為1.95和2.03 min。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于泰妙菌素和沃尼妙林含有羰基、羥基和?；然鶊F(tuán)，故采用電噴霧離子源下正離子掃描(ESI+)模式。取200 μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以 20 μL·min－1的流速注入離子源，在ESI(+)的模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，得到泰妙菌素和沃尼妙林的分子離子[M+H]+的m/z分別為494.08和565.46。調(diào)試確定毛細(xì)管電壓為3.20 V，泰妙菌素的錐孔電壓為30 V，沃尼妙林的錐孔電壓為10 V。在加載電壓和兩者的錐孔電壓不變的情況下，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描。通過改變碰撞能量，確定響應(yīng)值最高的子離子為定量離子，響應(yīng)值次高的子離子為定性離子。圖5即為泰妙菌素和沃尼妙林的二級質(zhì)譜圖。

圖5 泰妙菌素和沃尼妙林的二級質(zhì)譜圖Fig.5 Secondary mass spectrometry graph of tiamulin and valnemulin

2.4 線性范圍檢出限與定量限（標(biāo)準(zhǔn)曲線）

優(yōu)化色譜條件、質(zhì)譜條件和前處理?xiàng)l件后，配制成濃度分別為 0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ng·mL－1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在1.5節(jié)和1.6節(jié)的色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，得到線性回歸方程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，泰妙菌素和沃尼妙林的線性回歸方程分別為

泰妙菌素和沃尼妙林在0.1～10.0 ng·mL－1內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，確定本方法泰妙菌素和沃尼妙林的檢出限和定量限分別為0.03 和0.1 μg·kg－1。目前，我國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 4483―2016《出口活魚泰妙菌素檢測技術(shù)規(guī)范》[28]中，泰妙菌素的檢測限為 50 μg·kg－1，因此，本實(shí)驗(yàn)建立的方法能夠滿足國內(nèi)檢測的要求。

2.5 方法回收率和精密度

對草魚、對蝦和梭子蟹分別進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，在每批次樣品中分別加入 0.1，1.0，5.0，10.0 μg·kg-14種水平的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，并設(shè)置空白對照組，每個水平平行測定6次，共進(jìn)行3批次實(shí)驗(yàn)，最終計(jì)算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，泰妙菌素和沃尼妙林的平均回收率為87%～114%，進(jìn)一步證明樣品前處理方法優(yōu)化后降低了基質(zhì)的干擾。實(shí)驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%～6.50%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.19%～9.96%，均小于10%。

2.6 實(shí)際樣品驗(yàn)證

將 50條鯽魚喂養(yǎng)在濃度為 0.5 μg·mL－1的泰妙菌素和沃尼妙林混合溶液中，連續(xù)藥浴7 d。利用已建立的方法測定鯽魚體內(nèi)泰妙菌素和沃尼妙林的殘留量，結(jié)果如表4所示。鯽魚的各個組織中均能檢測到泰妙菌素和沃尼妙林，其中，腎臟組織中泰妙菌素和沃尼妙林的總殘留量最高，為453.81 μg·kg－1，肝臟次之，為 236.97 μg·kg－1。實(shí)驗(yàn)表明，本方法能用于日常泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的測定。

3 結(jié) 論

本研究采用強(qiáng)陽離子固相萃取技術(shù)凈化，選用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測，建立了一種能夠檢測水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的方法。方法采用乙腈提取1次，振蕩超聲后用MCX強(qiáng)陽離子交換柱凈化，檢測時間僅為5 min，高效準(zhǔn)確。選用內(nèi)標(biāo)法定量分析泰妙菌素，外標(biāo)法定量分析沃尼妙林，在空白草魚、對蝦和梭子蟹中分別加入 0.1，1.0，5.0 和 10.0 μg·kg－14個添加水平，2種抗生素藥物的平均回收率為87%～114%，RSD小于10%。優(yōu)化各項(xiàng)參數(shù)條件后，可降低基質(zhì)效應(yīng)，縮短前處理時間，且靈敏度較高，檢出限和定量限分別為 0.03和 0.1 μg·kg－1，滿足國內(nèi)檢測的相關(guān)要求，也為水產(chǎn)品中泰妙菌素和沃尼妙林殘留量的檢測提供了技術(shù)支持，可廣泛應(yīng)用于檢測機(jī)構(gòu)和水產(chǎn)企業(yè)的日常檢驗(yàn)監(jiān)測工作。

表3 樣品中4種濃度水平的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recovery and relative standard deviation of analytes spiked with 0.1，1.0，5.0 and 10.0 μg·kg-1in sample（n=6）

表4 鯽魚各組織中泰妙菌素和沃尼妙林的殘留量Table 4 Crucian carp residues in various organizations