益生菌對(duì)急性肝內(nèi)膽汁淤積模型大鼠肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究*

王菊平，馬姝麗，李小芹，周 方

(鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院:1.藥學(xué)部;2.消化科,鄭州 450000)

肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)生與肝細(xì)胞功能異常、膽管損傷密切相關(guān)，典型癥狀為黃疸、大便淺黃，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)中膽紅素上升[1-2]。急性肝內(nèi)膽汁淤積好發(fā)于兒童，特別是嬰兒，是導(dǎo)致其殘疾或死亡的主要原因[3]。臨床治療以熊去氧膽酸等藥物治療為主，價(jià)格較高，且部分患兒無效。

益生菌可促使腸道菌群生態(tài)平衡，其常用于腸道感染防治[4]。相關(guān)報(bào)道發(fā)現(xiàn)益生菌對(duì)慢性酒精性肝損傷、膽汁淤積性黃疸有一定療效[5-6]。但目前關(guān)于益生菌對(duì)急性肝內(nèi)膽汁淤積性肝損傷療效的相關(guān)報(bào)道較少。本研究對(duì)α-異硫氰酸萘酯(ANIT)致急性肝內(nèi)膽汁淤積幼鼠模型行益生菌預(yù)處理，檢測(cè)二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸(D-LA)等腸黏膜屏障功能血清指標(biāo)及肝細(xì)胞核因子-κB(NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)，分析益生菌的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 斷乳2周的健康、雄性清潔級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量65～100 g，購(gòu)自上海義森生物科技有限公司，由本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2藥物、主要試劑及設(shè)備 益生菌-培菲康膠囊(上海信誼藥廠有限公司，規(guī)格：0.21 g，國(guó)藥準(zhǔn)字S10950032)；α-萘異硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT，美國(guó)Sigma公司)；總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(上海超研生物科技有限公司)；DAO、D-LA試劑盒(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司)，多克隆鼠抗NF-κB抗體、多克隆羊抗TNF-α抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；邁瑞B(yǎng)S-350全自動(dòng)生化分析儀(武漢盛世達(dá)醫(yī)療設(shè)備有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2方法

1.2.1藥物配置 ANIT使用前通過麻油制備為1%溶液；益生菌膠囊、熊去氧膽酸片使用前通過溫生理鹽水稀釋。

1.2.2分組與造模 60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)72 h，將其分為正常組、模型組與干預(yù)組，每組20只。干預(yù)組大鼠每天1次給予益生菌4.2×108個(gè)活菌數(shù)/kg灌胃，正常組與模型組大鼠則行同等量溫生理鹽水灌胃。第5天模型組、干預(yù)組行0.5%(50 mg/kg)ANIT麻油混合液10 g/L灌胃構(gòu)建急性肝內(nèi)膽汁淤積模型，正常組不予以ANIT干預(yù)，僅給予等量麻油灌胃。為保證灌胃藥物吸收的充分性，所有大鼠灌胃前后12 h內(nèi)禁食，但不禁飲。造模后48、72 h分別處死大鼠，每組各10只。

1.2.3標(biāo)本采集 處死大鼠前對(duì)其注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg，腹腔逐一剪開，腹主動(dòng)脈分離，抽取3 mL動(dòng)脈血，以3 000 r/min離心10 min，上清液提取后用于血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。取血后切取肝左葉組織，4%多聚甲醛固定。

1.2.4血清相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 通過邁瑞B(yǎng)S-350全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組大鼠血清TBIL、DBIL、ALT水平；通過ELISA法測(cè)定血清DAO、D-LA水平。

1.2.5肝組織檢測(cè) 肝組織常規(guī)石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，脫水，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理情況。免疫組織化學(xué)法測(cè)定肝組織NF-κB、TNF-α表達(dá)，SP法免疫組織化學(xué)染色，苯二胺顯色，蘇木素復(fù)染，封片(細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)存在棕黃色顆粒)。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，測(cè)定吸光度(A)值，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。

2 結(jié) 果

2.1大鼠情況 各組大鼠均存活，正常組大鼠活動(dòng)、皮毛、尿液顏色均正常；模型組大鼠毛發(fā)無光澤，活動(dòng)量減少，體質(zhì)量降低，尿液為黃色；干預(yù)組大鼠活動(dòng)、體質(zhì)量較模型組顯著改善。

2.2各組大鼠血清肝功能指標(biāo)比較 模型組、干預(yù)組造模后48、72 h血清TBIL、DBIL、ALT水平均明顯高于正常組(P<0.05)，而干預(yù)組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清TBIL、DBIL、ALT水平比較

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.3各組大鼠DAO、D-LA水平比較 模型組、干預(yù)組造模后48、72 h血清DAO、D-LA水平均明顯高于正常組(P<0.05)，且干預(yù)組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清DAO、D-LA水平比較

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較

2.4肝組織病理觀察 正常組大鼠肝臟外觀、顏色均正常，顯微鏡下肝小葉顯示清晰，無肝細(xì)胞病變發(fā)生。模型組大鼠肝臟外觀顯著腫脹，顯微鏡下肝小葉輪廓模糊，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)匯管區(qū)，肝細(xì)胞嗜酸性變、點(diǎn)狀壞死，造模后48 h上述癥狀進(jìn)一步加重，造模后72 h上述癥狀有所緩解。干預(yù)組大鼠肝臟病變較模型組明顯減輕，見圖1。

圖1各組動(dòng)物典型的肝組織病理圖片

2.5各組大鼠肝組織NF-κB、TNF-α表達(dá)比較 模型組、干預(yù)組造模后48、72 h肝組織NF-κB、TNF-α表達(dá)均明顯高于正常組(P<0.05)，且干預(yù)組低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠肝組織NF-κB、TNF-α表達(dá)比較

a：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，與模型組比較

3 討 論

肝內(nèi)膽汁淤積主要由膽汁分泌過多、排泄異常引起，膽汁過分堆積易損傷肝細(xì)胞，而肝細(xì)胞損傷會(huì)對(duì)腸黏膜造成不同程度的影響，引發(fā)腸道功能紊亂，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征(SIRS)、多器官功能衰竭，威脅患者生命[7-8]，為此修復(fù)機(jī)體腸黏膜屏障至關(guān)重要。此外，急性肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)生后NF-κB、TNF-α等細(xì)胞因子水平明顯上升，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，也會(huì)破壞腸黏膜屏障。

益生菌為一種常見微生態(tài)制劑，在膽汁淤積性肝病、腸道菌群改善等方面應(yīng)用較多，補(bǔ)充有效劑量益生菌一方面可刺激腸道內(nèi)有益菌生長(zhǎng)，另一方面可經(jīng)多種途徑抑制腸道內(nèi)致病菌生長(zhǎng)、黏附、浸潤(rùn)，有利于腸道內(nèi)菌群恢復(fù)，同時(shí)可促進(jìn)膽汁排泄，抑制炎性因子產(chǎn)生或釋放，改善腸黏膜屏障功能[9]。相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)益生菌能保護(hù)酒精性肝損傷，這與其對(duì)腸道微環(huán)境調(diào)整，增強(qiáng)腸道屏障功能有關(guān)[10]。謝基明等[11]研究發(fā)現(xiàn)益生菌可能通過抑制TLR4/ERK通路，使過氧化物酶體增殖劑激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)上調(diào)以發(fā)揮保護(hù)急性肝損傷的目的。根據(jù)肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)病機(jī)制及相關(guān)研究，筆者對(duì)與腸黏膜屏障功能相關(guān)的指標(biāo)(D-LA、DAO、織NF-κB、TNF-α)進(jìn)行分析，其中D-LA、DAO分別為細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物和腸黏膜上層絨毛細(xì)胞內(nèi)酶，腸黏膜被損壞時(shí)，D-LA、DAO被大量釋放到血液，致使血清D-LA、DAO水平顯著上升。為此臨床常將這兩項(xiàng)作為腸道屏障功能評(píng)價(jià)的血清指標(biāo)。肝內(nèi)膽汁淤積發(fā)生時(shí)多伴腸源性內(nèi)毒素血癥，可刺激機(jī)體NF-κB、TNF-α等炎性因子釋放[12]，而上述因子會(huì)損傷相關(guān)結(jié)構(gòu)及功能，進(jìn)而損傷機(jī)體腸黏膜屏障功能。NF-κB是一種在人體內(nèi)多種細(xì)胞中分布的轉(zhuǎn)錄因子，可多向調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。一旦細(xì)胞被胞外信號(hào)刺激，會(huì)激活單個(gè)或多個(gè)信號(hào)傳遞途徑，致使IκB被磷酸化、泛素化，且經(jīng)由26S蛋白酶降解和NF-κB解離[13]。NF-κB被激活，快速由細(xì)胞質(zhì)移動(dòng)至細(xì)胞核，與前炎性細(xì)胞因子(如TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等靶基因相關(guān)序列結(jié)合，基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)，促使TNF-α等大量釋放，放大初始炎癥信號(hào)。NF-κB活化后對(duì)TNF-α等炎性介質(zhì)觸發(fā)，引發(fā)瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)。TNF-α被證實(shí)通過下調(diào)閉合蛋白表達(dá)，以損壞腸黏膜屏障[14]。

ANIT為間接肝毒劑，通過肝細(xì)胞毒性、膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等促使肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞損傷、壞死，同時(shí)可造成小葉間膽管附近炎癥出現(xiàn)，導(dǎo)致膽管阻塞，膽汁淤積明顯，且伴肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害[15]。本實(shí)驗(yàn)通過ANIT造模，操作簡(jiǎn)單，與人類肝內(nèi)膽汁淤積表現(xiàn)一致性較高。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ANIT所致急性肝內(nèi)膽汁淤積大鼠模型成功，大鼠血清TBIL、DBIL、ALT、DAO、D-LA水平比正常組明顯上升，可見膽汁淤積會(huì)導(dǎo)致肝損傷，影響腸道黏膜功能。本研究模型組、干預(yù)組造模后72 h肝功能及其他相關(guān)指標(biāo)比造模后48 h均有所下降，與熊小麗等[7]報(bào)道相符。分析其原因：ANIT誘導(dǎo)肝內(nèi)膽汁淤積形成中在膽汁內(nèi)與還原性谷胱甘肽結(jié)合，隨時(shí)間推移，結(jié)合的ANIT慢慢解離排泄，進(jìn)而72 h后肝臟膽汁淤積有所改善，這為今后藥物干預(yù)設(shè)立關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)提供了依據(jù)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)與模型組比較，干預(yù)組造模后48、72 h血清TBIL、DBIL、ALT水平均顯著低，提示益生菌能明顯改善SNIT所致肝內(nèi)膽汁淤積大鼠肝損傷程度。分析其原因可能與益生菌下調(diào)血清DAO、D-LA水平及NF-κB、TNF-α表達(dá)有關(guān)。益生菌通過調(diào)整腸道內(nèi)菌群，改變腸道微生態(tài)環(huán)境，減輕了炎性反應(yīng)，促進(jìn)了腸道黏膜屏障功能修復(fù)，進(jìn)而有利于膽汁淤積癥狀緩解及肝功能恢復(fù)。

綜上所述，益生菌可通過下調(diào)血清DAO、D-LA水平及NF-κB、TNF-α表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，修復(fù)腸黏膜屏障功能，達(dá)到治療肝內(nèi)膽汁淤積的目的。