6個(gè)假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良家系的產(chǎn)前診斷

徐晨陽(yáng) 項(xiàng)延包 李煥錚 周麗麗 徐云芝 張康梁 徐雪琴

假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良為常見的原發(fā)于肌肉組織的X連鎖隱性遺傳病，活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病率約為1/3 500[1]，患者以男性多見，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性的肌肉萎縮，站立和行走困難，可累及心臟，部分患兒存在智力障礙[2]。根據(jù)臨床表型又可分為較嚴(yán)重的杜氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和較緩和的貝氏進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良（Becker muscular dystrophy，BMD）。患兒攜帶的患病基因大多遺傳自父母，約1/3為新發(fā)突變[3]。其發(fā)病基因DMD即編碼抗肌萎縮蛋白基因位于X染色體p21.2p21.1區(qū)域，全長(zhǎng)2.4Mb，包含87個(gè)外顯子，是目前已知最長(zhǎng)的基因。約60%患者存在DMD基因外顯子缺失，缺失熱點(diǎn)為外顯子E3-19以及E45-54[4]；10%患者存在DMD基因外顯子重復(fù)，其余患者為點(diǎn)突變、剪切體變異或小的插入/缺失變異[5-7]。本病的臨床診斷主要依靠患者臨床表型、病理檢查和分子診斷等。分子診斷具有創(chuàng)傷小、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上尤其適用于產(chǎn)前診斷預(yù)防患兒出生。本研究聯(lián)合多重連接依賴探針擴(kuò)增技術(shù)（multiples ligation-dependent probe amplification，MLPA）、單體型連鎖分析及短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STR）位點(diǎn)檢測(cè)對(duì)6個(gè)假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良家系行DMD基因診斷和產(chǎn)前分子診斷，旨在為上述家系的遺傳咨詢提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 本研究通過(guò)溫州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵循知情同意原則收集2016年至2018年于本院遺傳門診行產(chǎn)前遺傳咨詢的6個(gè)假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良家系（圖1）的臨床資料，該6個(gè)家系先證者均為男性，平均就診年齡10歲，均表現(xiàn)為雙下肢肌無(wú)力，經(jīng)本院或其他醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床診斷為進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良。其中家系3先證者主要臨床表現(xiàn)為走路緩慢、下蹲困難，家系6先證者臨床表現(xiàn)為無(wú)法站立及抬臂，其余4個(gè)家系先證者表現(xiàn)為行走不良。6個(gè)家系待檢孕婦均為先證者母親，僅家系3中孕婦口述偶發(fā)肌肉酸痛及痙攣，其余5個(gè)家系的孕婦均無(wú)明顯臨床表現(xiàn)。另外家系1曾于2013年至本院行首次產(chǎn)前診斷[8]，家系2曾于2015年至本院行首次產(chǎn)前診斷，結(jié)果均診斷為男性患胎，孕婦最終選擇終止妊娠。本次研究期間行產(chǎn)前診斷的胎兒共6例，于孕婦妊娠11～13周取胎兒絨毛樣本適量或妊娠18～23周取胎兒羊水10ml，同時(shí)采集先證者及孕婦外周靜脈血2ml。

圖1 6個(gè)假肥大性肌營(yíng)養(yǎng)不良家系圖[從左到右依次為家系（F）1、2、3、4、5、6]

1.2 研究方法

1.2.1 核酸提取 外周血基因組DNA提取采用Qiagen公司的QIAamp Blood Mini Kit試劑盒，胎兒絨毛基因組DNA提取采用廈門艾德生物的核酸提取試劑盒，胎兒羊水基因組DNA提取采用廈門愷碩生物的DNA提取試劑盒（110型），抽提出的DNA于Thermo Scientific的 NanoDrop 2000c進(jìn)行精確定量，并對(duì)DNA質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。1.2.2 MLPA檢測(cè) 采用荷蘭MRC-Holland公司的SALSA MLPA試劑盒P034、P035對(duì)孕婦、先證者及胎兒樣本進(jìn)行MLPA檢測(cè)，按說(shuō)明書進(jìn)行變性、雜交、連接和PCR。PCR產(chǎn)物與LIZ-500及去離子甲酰胺按比例混合，在ABI公司的3130自動(dòng)化基因分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，原始數(shù)據(jù)應(yīng)用Coffalyser軟件分析處理，得出基因相對(duì)拷貝數(shù)比值。根據(jù)試劑盒說(shuō)明，正?？截悢?shù)比值范圍為0.70～1.30。

1.2.3 單體型連鎖分析 針對(duì)DMD基因序列內(nèi)部及上下游區(qū)域8個(gè)單體型較高的STR位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成熒光標(biāo)記引物，采用ABI公司的3130自動(dòng)化基因分析儀及GeneMapper分析軟件對(duì)6個(gè)家系的先證者、孕婦及胎兒進(jìn)行單體型連鎖分析。

1.2.4 STR位點(diǎn)檢測(cè) 采用上海天昊醫(yī)藥的Human Personal Identification Detection Kit試劑盒進(jìn)行STR位點(diǎn)檢測(cè)確認(rèn)胎兒樣本親緣性并排除母源污染，在ABI公司的3130自動(dòng)化基因分析儀上分別對(duì)6例胎兒及孕婦DNA 樣本的 16個(gè) STR 位點(diǎn)（D5S818、D7S820、D8S588、D13S317、D16S539、D18S51、D8S1179、D2S1338、THO1、G4S0001、G2S0002、vWA、G15S0001、G5S0001、G7S0005和G10S0001)進(jìn)行測(cè)定,然后用GeneMapper軟件自動(dòng)分析等位基因的基因型。

2 結(jié)果

2.1 MLPA檢測(cè)結(jié)果 6個(gè)家系成員MLPA檢測(cè)DMD基因的結(jié)果和妊娠結(jié)局見表1。

由表1可見，6例先證者中外顯子缺失型5例，分別為E51缺失、E56-66缺失、E46-47缺失、E10-52缺失、E49-51缺失,重復(fù)型1例為E3-7重復(fù)；6例患者母親中 4 例為缺失型攜帶者，2 例（F1:Ⅰ-2、F5:Ⅰ-2）DMD基因未檢出異常；研究期間共6例胎兒行產(chǎn)前分子診斷，其中缺失型男性患胎 3 例（F2:Ⅱ-3、F3:Ⅱ-2、F6:Ⅱ-2），正常女胎 2 例（F1:Ⅱ-3、F5:Ⅱ-2），攜帶者女胎 1 例（F4:Ⅱ-2）。各家系DMD基因的MLPA檢測(cè)圖譜見圖2。

2.2 連鎖分析結(jié)果 對(duì)孕婦、胎兒和先證者進(jìn)行單體型連鎖分析，結(jié)果顯示胎兒F2:Ⅱ-3、F3:Ⅱ-2及已終止妊娠的F1:Ⅱ-2、F2:Ⅱ-2于X染色體有1種單體型，F(xiàn)4:Ⅱ-2有2種單體型，遺傳的母源X染色體單體型均與先證者一致，與MLPA結(jié)果相符；胎兒F5:Ⅱ-2有2個(gè)單體型，遺傳的母源X染色體單體型與先證者不一致，亦與MLPA結(jié)果相符。

家系1胎兒F1:Ⅱ-3遺傳的母源X染色體單體型與先證者F1:Ⅱ-1一致，但MLPA檢測(cè)結(jié)果與其母親相同為未見拷貝數(shù)異常，而F1:Ⅱ-2與先證者單體型一致且均為缺失型患者，詳見表2。

家系6胎兒F6:Ⅱ-2與先證者F6:Ⅱ-1均有1種單體型，表示男性胎兒。兩者進(jìn)行連鎖分析的8個(gè)位點(diǎn)中有6個(gè)位點(diǎn)一致，2個(gè)位點(diǎn)不一致，詳見表2。

表1 各家系成員DMD基因MLPA檢測(cè)結(jié)果

圖2 各家系DMD基因的MLPA檢測(cè)圖譜（a：家系1的E51缺失；b：家系2的E56-66缺失；c：家系3的E46-47缺失；d：家系4的E10-52缺失；e：家系5的E3-7重復(fù)；f：家系6的E49-51缺失）

表2 家系1、6的單體型連鎖分析結(jié)果

2.3 STR位點(diǎn)檢測(cè) 本次研究采集胎兒羊水樣本5例，絨毛樣本1例。比對(duì)各胎兒樣本與孕婦外周血DNA的STR位點(diǎn)，結(jié)果顯示6例胎兒樣本，分別有12、10、10、9、11、9 個(gè)位點(diǎn)可以排除母源污染。

3 討論

DMD基因位于Xp21.2p21.1區(qū)域，全長(zhǎng)2.4Mb，包含87個(gè)外顯子，是目前已知最長(zhǎng)的基因。DMD基因突變頻率高和突變形式多樣的形式多樣，其中缺失突變占55%～65%，重復(fù)突變占5%～10%，其他微小突變約占25%～30%[4-6]。本次研究未發(fā)現(xiàn)微小突變，納入的6個(gè)家系均為缺失重復(fù)突變，且以缺失突變?yōu)橹?，?例（5/6），重復(fù)突變僅1例（1/6）。5例缺失突變中家系1存在DMD基因E51缺失，家系3存在E46-47缺失，家系4存在E10-52缺失，家系6存在E49-51缺失，均涉及缺失熱點(diǎn)區(qū)域外顯子 E45～54（4/5）。

5例缺失型先證者年齡相近，其中先證者（F6:Ⅱ-1）表現(xiàn)為重型的上下肢肌無(wú)力（3個(gè)外顯子缺失），先證者（F1:Ⅱ-1、F2:Ⅱ-1、F4:Ⅱ-1）表型相對(duì)較輕，肌無(wú)力暫不累及上肢（分別有1、11、43個(gè)外顯子缺失），先證者（F3:Ⅱ-1）臨床表型最輕，能緩慢行走（2個(gè)外顯子缺失），這5例家系無(wú)明顯的表型嚴(yán)重程度和缺失范圍的相關(guān)性。DMD/BMD為X連鎖隱性遺傳病，患者以男性多見，女性為攜帶者，但由于X染色體的隨機(jī)失活，約20%女性會(huì)存在輕微的臨床表型，如肌無(wú)力、心臟受累、認(rèn)知功能障礙、肌肉疼痛或痙攣等[9]。該機(jī)制可能為先證者母親（F3:Ⅰ-2）存在的肌肉酸痛及痙攣提供一種解釋，但由于未進(jìn)一步進(jìn)行血清肌酶、心電圖、肌電圖等相關(guān)檢測(cè)，因此不排除其他偶發(fā)因素。

文獻(xiàn)表明DMD患者中約1/3為新發(fā)突變，2/3源自遺傳[2]，又有文獻(xiàn)表明新發(fā)突變中14%是由于生殖腺鑲嵌體導(dǎo)致[10]，生殖腺鑲嵌體本身通常不發(fā)病，但可產(chǎn)生正常和異常兩種配子。通過(guò)對(duì)6例孕婦外周血的基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)孕婦（F1:Ⅰ-2、F5:Ⅰ-2）的DMD基因均未見變異，表明這2例先證者可能為新發(fā)突變或其母親為生殖腺鑲嵌體。其中孕婦（F1:Ⅰ-2）與本次腹中女胎（F1:Ⅱ-3）均未攜帶變異，并且女胎（F1:Ⅱ-3）的其中1種單體型與先證者相同，但從該孕婦曾連續(xù)孕有兩胎相同基因突變患兒（F1:Ⅱ-1、F1:Ⅱ-2），可推測(cè)該家系先證者新發(fā)突變可能性較低，而其母親為該缺失型突變的生殖腺鑲嵌體可能性高。因此，對(duì)于先證者為新發(fā)突變型DMD基因患者,盡管其母親非相同突變攜帶者,但仍不能排除生殖腺鑲嵌體可能,再次妊娠時(shí)需進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷[11]。

目前，國(guó)內(nèi)外常用的DMD/BMD分子檢測(cè)技術(shù)包括多重PCR技術(shù)、MLPA技術(shù)、直接測(cè)序法、NGS、單體型分析等[12-14]。前兩者適用于DMD基因缺失/重復(fù)突變的檢測(cè)，直接測(cè)序法適用于微小突變的檢測(cè)，NGS可同時(shí)檢測(cè)缺失、重復(fù)和點(diǎn)突變，但目前該技術(shù)成本昂貴且費(fèi)時(shí)較長(zhǎng),尚未廣泛應(yīng)用于DMD基因檢測(cè)[15]，而單體型分析更適合作為信息完整家系的輔助診斷技術(shù)。運(yùn)用STR單體型連鎖分析診斷DMD基因的局限性在于無(wú)法排除 5%-10%的基因內(nèi)重組[6，16]，本研究中胎兒（F6:Ⅱ-2）與先證者（F6:Ⅱ-1）存在2個(gè)STR位點(diǎn)不一致，表明該家系DMD基因內(nèi)發(fā)生了聯(lián)會(huì)交換，只采用單體型連鎖分析無(wú)法準(zhǔn)確進(jìn)行產(chǎn)前診斷。

綜上所述，不同臨床背景的家系采用不同技術(shù)方法的組合可以提高檢出率。本次研究采用MLPA技術(shù)對(duì)6個(gè)家系進(jìn)行DMD基因檢測(cè)明確了該6個(gè)家系的基因型，同時(shí)結(jié)合單體型連鎖分析確保了產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性，為進(jìn)一步的遺傳咨詢和診療提供可靠的依據(jù)。