澤瀉湯加味方通過AT1R通路抑制高鹽和AngII誘導(dǎo)HBZY-1中NOX4表達(dá)的研究

劉凱 趙娟 劉玉玲 崔海鵬 董雅潔 盧鍇鋒 孫曉旭 王途 張樹峰

〔摘要〕 目的 探討澤瀉湯加味方通過AT1R通路抑制高鹽和AngⅡ誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞（HBZY-1）中NOX4表達(dá)并初探其作用機(jī)制。方法 將HBZY-1細(xì)胞隨機(jī)分為正常組，高鹽和AngII誘導(dǎo)模型組，纈沙坦組，澤瀉湯加味方中藥高、中、低劑量組。造模結(jié)束后，纈沙坦組采用纈沙坦（1 μmol/L）刺激，中藥組分別用澤瀉湯加味方中藥高（2 mg/L）、中（1 mg/L）、低（0.5 mg/L）劑量組刺激，正常組正常培養(yǎng)。24 h后收集樣本，RT-qPCR方法檢測細(xì)胞中AT1R、NOX4的mRNA表達(dá)水平，MTT法測定細(xì)胞活性，Western blot方法檢測細(xì)胞中AT1R、NOX4的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，采用AT1R抑制劑驗證中藥下調(diào)NOX4具體作用通路。結(jié)果 與正常組比較，各給藥組細(xì)胞生長受到明顯抑制，RT-qPCR及Western blot結(jié)果顯示，AT1R、NOX4的mRNA與蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），中藥組與AT1R抑制劑組NOX4表達(dá)均下調(diào)。結(jié)論 澤瀉湯加味方可通過下調(diào)AT1R、NOX4 mRNA及AT1R、NOX4蛋白水平來保護(hù)鹽敏感性高血壓腎損傷，進(jìn)而達(dá)到延緩腎纖維化的作用，具體作用機(jī)制是通過抑制AT1R信號通路進(jìn)而下調(diào)NOX4蛋白表達(dá)水平。

〔關(guān)鍵詞〕 鹽敏感性高血壓;腎纖維化;澤瀉湯;血管緊張素Ⅱ;AT1R通路;NOX4

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.05.006

〔Abstract〕 Objective To investigate the inhibitory effects of modified Zexie Decoction on NOX4 expression in glomerular mesangial cells （HBZY-1） induced by high salt and AngII through AT1R pathway and to explore its mechanism. Methods HBZY-1 was randomly divided into a normal group， a high salt and AngII induced model group， a Valsartan group， a Zexie Decoction modified Chinese herbal medicine high， medium and low dose group. After modeling， the Valsartan group was stimulated by Valsartan （1 1 μmol/L）， and the administration group was stimulated by Zexie Decoction with high （2 mg/L）， medium （1 mg/L） and low （0.5 mg/L） doses of traditional Chinese medicine respectively. The normal group was cultured normally. After 24 hours， samples were collected. The mRNA expression of AT1R and NOX4 in cells were detected by RT-q PCR， and cell viability was measured by MTT. The protein expression levels of AT1R and NOX4 were detected by Western blot， and specific pathways of NOX4 down-regulation were verified by AT1R inhibitors. Results Compared with the normal group， the growth of cells in each group was inhibited significantly. RT-qPCR and western blot showed that the mRNA expression and the protein expression of AT1R and NOX4 were significantly decreased （P<0.05）， while the expression of NOX4 was down-regulated in both Chinese herbal medicine and AT1R inhibited group. Conclusion Modified Zexie Decoction can protect salt-sensitive hypertensive kidney injury by down-regulating AT1R， NOX4， mRNA， AT1R， NOX4 protein levels， and then delay renal fibrosis. The specific mechanism is to down-regulate NOX4 protein expression by inhibiting AT1R signaling pathway.

〔Keywords〕 salt-sensitive hypertension; renal fibrosis; Zexie Decoction; angiotension Ⅱ; ATIR pathway; NOX4

由于飲食結(jié)構(gòu)變化，鹽敏感性高血壓已成為當(dāng)下最常見的繼發(fā)性高血壓，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。研究表明[2-4]，腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin angiotensin aldosterone system， RAAS）相關(guān)的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（AngII-NADPH-ROS信號通路）異常被認(rèn)為是鹽敏感性高血壓發(fā)生的重要機(jī)制之一。越來越多的研究表明[5]，中醫(yī)藥治療鹽敏感性高血壓，具有獨(dú)特優(yōu)勢。本項目前期研究證實(shí)，澤瀉湯加味方在臨床治療鹽敏感性高血壓效果明顯[6]，體內(nèi)實(shí)驗證明，澤瀉湯加味方對高鹽高血壓大鼠腎臟有明顯的保護(hù)作用[7-8]。盡管如此，仍缺少運(yùn)用科學(xué)系統(tǒng)的實(shí)驗方法對澤瀉湯加味方治療鹽敏感性高血壓作用及其詳細(xì)作用機(jī)制展開研究。本研究以高鹽和AngII誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞模型作為研究對象，初步研究了澤瀉湯加味方對RAAS相關(guān)信號通路AngII-NADPH-ROS的影響，為臨床進(jìn)一步將澤瀉湯加味方研發(fā)成有效、安全的新型降壓藥物提供可靠的實(shí)驗依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 ?藥物

澤瀉湯加味方組成：澤瀉21 g（批號0171422112），白術(shù)9 g（批號160180101），澤蘭15 g（批號512150401），石菖蒲15 g（批號170630）;澤瀉湯加味方制備工藝：按比例配備，加8倍體積蒸餾水浸泡4 h，煎煮1 h，過濾取濾液，藥渣中再加6倍體積蒸餾水，煎煮1 h，過濾取濾液，將2次濾液合并，濃縮制成5 mg/mL水煎劑，保存于-20 ℃冰箱中備用;纈沙坦膠囊（北京諾華制藥有限公司，批號X0796）。

1.2 ?細(xì)胞

大鼠腎小球系膜細(xì)胞株：HBZY-1（購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號：BNCC341790）。

1.3 ?試劑

DMEM-H培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）;胎牛血清（美國Sigma公司）;Trizol裂解液（R0016）、RIPA裂解液（P0013B）、Bradford蛋白濃度測定試劑盒（P0006）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（P0018S）均購于碧云天生物技術(shù)有限公司;TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒（KR104）、SuperReal PreMix SYBR Green（FP204）均購于天根生化科技有限公司;兔抗大鼠AT1R（ab18801）、NOX4（ab129068）均購于Abcam公司;兔抗大鼠β-actin抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔、兔抗小鼠二抗均購于Bioworlde公司。PCR引物由大連寶生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.4 ?主要儀器

T100 RT-qPCR儀、Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.5 ?方法

1.5.1 ?體外實(shí)驗蛋白樣本收集 ?將HBZY-1細(xì)胞放入加有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的MEM-H培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)皿85%開始傳代，取5～9代對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，采用NaCl 137 mmol/L和AngⅡ 1×10-6 mmol/L刺激大鼠腎小球系膜細(xì)胞24 h誘導(dǎo)高鹽細(xì)胞模型，正常組正常培養(yǎng)。隨后將細(xì)胞分為正常組，模型組，纈沙坦（1 μmol/L）組，中藥高、中、低劑量組，中藥劑量由高到低分別為2、1、0.5 mg/L，藥物干預(yù)24 h后，收集細(xì)胞，分別提取總RNA及蛋白質(zhì)，以備后續(xù)實(shí)驗。

1.5.2 ?細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗 ?采用MTT法，取對數(shù)增長期的細(xì)胞均勻接種于96孔板內(nèi)，每孔密度大約為1×105個/mL，每組設(shè)5個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后加入含NaCl 137 mmol/L和AngⅡ 1×10-6 mmol/L培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗分為正常組，模型組，澤瀉湯加味方組，濃度由低到高分別為：0.2、0.5、1、2、3、5 mg/L，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL的5 g/L的MTT液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，于酶標(biāo)儀460 nm波長處測各孔OD值。計算公式如下：

存活率=（澤瀉湯加味方組OD值-空白對照組OD值）/（模型組OD值-空白對照組OD值）×100%

1.5.3 ?RT-qPCR法檢測mRNA的表達(dá) ?Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計進(jìn)行定量，TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA，SuperReal PreMix SYBR Green熒光定量檢測試劑盒分別檢測NOX4、β-actin mRNA的ct值，擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán);做溶解曲線。以各目的基因ct值與β-actin mRNA的ct值的差值為△ct，采用2-△△ct法計算各基因mRNA的相對表達(dá)水平。

1.5.4 ?Western blot法檢測蛋白質(zhì)的表達(dá) ?采用RIPA裂解液處理提取各組細(xì)胞的總蛋白，Bradford蛋白濃度測定試劑盒蛋白定量。45 μg蛋白于SDS-PAGE 12%分離膠分離并轉(zhuǎn)膜，常溫封閉1 h，NOX4（1∶5000）、β-actin（1∶10 000）一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗、兔抗小鼠二抗（1∶5 000），常溫孵育2 h，洗膜后用超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。各蛋白目的條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為各蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。

1.5.5 ?抑制劑對于對各組細(xì)胞AT1R、NOX4蛋白表達(dá)的影響 ?在分析細(xì)胞抑制率結(jié)果實(shí)驗中我們得出了中藥最佳抑制濃度，為進(jìn)一步探究澤瀉湯是否通過AT1R通路抑制高鹽和AngⅡ誘導(dǎo)的HBZY-1中NOX4的蛋白表達(dá)，我們設(shè)計了AT1R抑制劑組，通過中藥組與抑制劑組中NOX4蛋白表達(dá)來驗證中藥澤瀉湯加味方治療高血壓具體作用機(jī)制。

1.6 ?統(tǒng)計學(xué)分析方法

用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用“x±s”表示，組間兩兩比較采用LDS-t法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ?澤瀉湯加味方對鹽敏感性高血壓細(xì)胞抑制率的影響

檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常相比，各實(shí)驗組細(xì)胞增殖均受到抑制，其中纈沙坦組與各給藥組與正常組相比均具有顯著性差異（P<0.01），模型組雖受抑制但差異不明顯。與模型組相比，纈沙坦組及各給藥組細(xì)胞增殖抑制作用明顯，其中尤以澤瀉湯中劑量組抑制作用最為明顯（P<0.01），已趨近于陽性藥組，正常組與模型組相比無顯著性差異，具體結(jié)果見圖1。

2.2 ?澤瀉湯加味方對各組細(xì)胞AT1R、NOX4 mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組、中藥高劑量組細(xì)胞中AT1R的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），模型組、中藥低組細(xì)胞中NOX4的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及中藥高、中、低組AT1R、NOX4的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。各給藥組中，中藥中劑量組AT1R、NOX4的mRNA表達(dá)水平最接近正常組水平，組間無顯著性差異（P>0.05）。與纈沙坦組比較，中藥高劑量組AT1R的mRNA及中藥中劑量組NOX4的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），結(jié)果見圖2。

2.3 ?澤瀉湯加味方對各組細(xì)胞AT1R、NOX4蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中AT1R、NOX4蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，纈沙坦組及中藥中劑量組AT1R、NOX4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與纈沙坦組比較，中藥高、低劑量組AT1R、NOX4蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），中藥中劑量組AT1R、NOX4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。各劑量給藥組中，中藥中劑量組對AngII-NADPH-ROS信號通路的下調(diào)作用最為明顯，所得結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，見圖3。

2.4 ?抑制劑對各組細(xì)胞AT1R、NOX4蛋白表達(dá)的影響

AT1R抑制組與澤瀉湯中劑量中NOX4表達(dá)明顯降低（P<0.05），提示澤瀉湯可通過AT1R通路抑制高鹽和AngⅡ誘導(dǎo)的HBZY-1中NOX4的蛋白表達(dá)，其余各組相比無顯著性差異。見圖4。

3 討論

原發(fā)性高血壓是一種多基因遺傳和多種環(huán)境相互作用的結(jié)果[9]，在基因和環(huán)境共同作用下，我國高血壓患者已達(dá)到2億人[10]。鹽作為高血壓發(fā)病的主要因素之一，以往流行病學(xué)的研究和大量臨床試驗都證明食鹽的攝入量與高血壓的發(fā)病有著密切聯(lián)系[11]。20世紀(jì)70年代Kawasaki和Luft先后提出了鹽敏感性高血壓概念，針對高鹽與高血壓的發(fā)生發(fā)展關(guān)系及其機(jī)制研究進(jìn)入到新的階段[12-13]。

當(dāng)前，對于鹽敏感性高血壓的發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在以下幾個方面：遺傳機(jī)制、離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、交感神經(jīng)機(jī)制以及（RAAS）機(jī)制，其中，RAAS相關(guān)的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)分子（AngⅡ-NADPH-ROS信號通路）異常被認(rèn)為是鹽敏感性高血壓發(fā)生的重要機(jī)制之一[14-15]。研究表明[16]，血管緊張素Ⅱ（angiotensionⅡ，AngⅡ）是RAAS中最重要的效應(yīng)因子。正常情況下，AngⅡ通過與其受體AT1R結(jié)合，使交感神經(jīng)末梢釋放遞質(zhì)增多來維持體液穩(wěn)態(tài)，起到調(diào)節(jié)血壓作用。然而在各種致病因素的損害下，這種體液穩(wěn)態(tài)被破壞，則可導(dǎo)致鹽敏感性高血壓的發(fā)生[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，RAAS激活不僅在心臟纖維化中扮演重要角色，而且可能在高血壓的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[19]。AngⅡ是RAAS的主要效應(yīng)成分，通過與腎臟細(xì)胞AT1R結(jié)合產(chǎn)生一系列聯(lián)機(jī)反應(yīng)，共同誘導(dǎo)高血壓患者腎纖維化的發(fā)生。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶（NOX）是一種有多中蛋白質(zhì)亞基組成的復(fù)合體，現(xiàn)已證實(shí)NOX介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)與器官纖維化的發(fā)生密切相關(guān)，而NOX的亞基NOX4在其中發(fā)揮了至關(guān)重要中的作用[20]。本研究以腎小球系膜細(xì)胞為研究對象，以高鹽和AngⅡ誘導(dǎo)高血壓細(xì)胞模型，從RAAS負(fù)反饋調(diào)節(jié)異常變化著手，試圖從體外實(shí)驗探究中藥澤瀉湯與鹽敏感性高血壓發(fā)病過程中典型蛋白NOX4的關(guān)系并初步探討其作用機(jī)制。

目前臨床上應(yīng)用降壓藥物種類繁多，但大多數(shù)只能緩解高血壓的癥狀，較少針對鹽敏感性高血壓病因治療，且作用靶點(diǎn)單一、持久性差，使患者終身用藥。纈沙坦可阻斷AngⅡ與其受體AT1R結(jié)合而治療鹽敏感性高血壓。但長期服用纈沙坦等藥物，患者會出現(xiàn)頭痛、頭暈、病毒感染、上呼吸道感染、咳嗽、腹瀉、疲勞、鼻炎、背痛、惡心、咽炎及關(guān)節(jié)痛等副作用，對患者機(jī)體造成新的損害。鑒于中藥澤瀉湯加味方在治療鹽敏感性高血壓方面的獨(dú)特優(yōu)勢，本研究力圖找到能夠替代傳統(tǒng)藥物纈沙坦且毒副作用較小的有效治療鹽敏感性高血壓藥物。澤瀉湯加味方由漢·張仲景《金匱要略》澤瀉湯加澤蘭、石菖蒲組成，具有利水泄?jié)?、健脾化痰、活血化瘀之功效。本項目前期研究證實(shí)，該方在臨床治療鹽敏感性高血壓效果明顯，但缺少運(yùn)用科學(xué)實(shí)驗方法對該方治療鹽敏感性高血壓作用及機(jī)制的實(shí)驗研究[21-22]，所以在下一步實(shí)驗研究中，應(yīng)把重點(diǎn)放在細(xì)胞模型復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)以及引入合理蛋白抑制劑，將細(xì)胞實(shí)驗與基因敲除動物實(shí)驗相結(jié)合共同驗證實(shí)驗結(jié)論。

本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用高鹽與AngⅡ誘導(dǎo)的模型組細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖，這可能與腎小球系膜細(xì)胞過度增殖引起腎纖維化有關(guān)，纈沙坦組與各給藥組能明顯降低HBZY-1的增殖，其中以澤瀉湯中劑量組最為明顯。RT-qPCR與Western blot結(jié)果顯示，模型組中AT1R與NOX4 mRNA與蛋白水平均出現(xiàn)上調(diào)，提示模型組可通過上調(diào)AT1R與NOX4的水平進(jìn)而與AngⅡ發(fā)生聯(lián)機(jī)反應(yīng)共同引發(fā)鹽敏感性高血壓的腎纖維化。實(shí)驗結(jié)果證實(shí)，給予中加家味方澤瀉湯后，各劑量組AT1R與NOX4的水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)，由此我們可以推測澤瀉湯加味方可以有效抑制鹽敏感性高血壓患者腎纖維化的發(fā)生。除此之外，為了確實(shí)澤瀉湯是否通過AT1R通路調(diào)控NOX4蛋白表達(dá)，我們采用AT1R抑制劑纈沙坦和澤瀉湯中劑量組預(yù)先處理細(xì)胞24 h，再用高鹽和Ang Ⅱ誘導(dǎo)HBZY-1細(xì)胞，圖4結(jié)果亦證實(shí)了我們的猜想。

綜上所述，澤瀉湯加味方可以有效抑制鹽敏感性高血壓患者HBZY-1細(xì)胞的過度增殖而引發(fā)的腎纖維化，鹽敏感性高血壓患者腎纖維化主要與AT1R及NOX4蛋白上調(diào)有關(guān)，澤瀉湯加味方可以通過抑制AT1R信號通路進(jìn)而下調(diào)NOX4蛋白水平進(jìn)而起到延緩或減輕鹽敏感性高血壓患者腎臟功能下降的效果。NOX4基因是如何保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞功能尚待進(jìn)一步研究。

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