陳炎城 朱旭華 曾漢華

【摘要】 目的：探究并比較環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法（LAMP）在重癥肺炎病原菌檢測中的應(yīng)用價(jià)值。方法：收集2017年1-12月本院收治的87例重癥肺炎患者的分泌物標(biāo)本，包括深部痰液、支氣管吸出物、肺泡灌洗液，同時(shí)實(shí)施LAMP十三聯(lián)檢與痰培養(yǎng)檢查，觀察兩種檢查方法病原菌檢出情況，并對比病原菌檢出陽性率。結(jié)果：87例標(biāo)本中痰培養(yǎng)檢查病原菌為22例（25.29%），以銅綠假單胞菌（31.82%）為主且為單一病原菌感染;LAMP十三聯(lián)檢顯示陽性標(biāo)本41例（47.13%），其中單一病原菌感染24例（27.59%），混合病原菌感染17例（19.54%），以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（31.25%）及肺炎克雷伯菌（18.75%）為主，20～60歲、>60歲人群均以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染為主，不同年齡段結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;LAMP陽性率為47.13%，高于痰培養(yǎng)的25.29%（P<0.05），結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、肺炎衣原體及流感嗜血桿菌等部分病原菌痰培養(yǎng)未檢測出。結(jié)論：在重癥肺炎病原菌檢測中，LAMP十三聯(lián)檢可為臨床治療提供可靠實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)，患者以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染為主，為提高檢測準(zhǔn)確率可根據(jù)實(shí)際情況聯(lián)合其他檢測方法，指導(dǎo)用藥。

【關(guān)鍵詞】 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法; 痰培養(yǎng); 重癥肺炎; 病原菌

【Abstract】 Objective：To explore and compare the application value of loop-mediated isothermal amplification（LAMP）in pathogenic bacteria detection of severe pneumonia.Method：Secretion specimens of 87 patients with severe pneumonia admitted to our hospital from January 2017 to December 2017 were collected，it included deep sputum，bronchial aspirates and alveolar lavage fluid，at the same time，LAMP and sputum culture were carried out，the detection of pathogenic bacteria by two methods were observed，and the positive rate of pathogenic bacteria was compared.Result：Of 87 specimens，22 cases（25.29%）were pathogenic bacteria by sputum culture，pseudomonas aeruginosa（31.82%）was the main pathogen and only one pathogen was infected.LAMP showed that 41 cases（47.13%）positive specimens，including 24 cases（27.59%）of single pathogen infection，17 cases（19.54%）of mixed pathogen infection，mainly methicillin-resistant Staphylococcus aureus（31.25%）and Klebsiella pneumoniae（18.75%）.People aged 20-60 years and over 60 years were mainly methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection，with tuberculosis branches in different age groups，there was significant difference in Bacillus complex infection（P<0.05），the positive rate of LAMP in lower was 47.13% higher than 25.29% in sputum culture（P<0.05），some pathogenic bacteria such as Mycobacterium tuberculosis complex，Chlamydia pneumoniae and Haemophilus influenzae were not detected in sputum culture.Conclusion：In the detection of pathogenic bacteria in severe pneumonia，LAMP can provide reliable laboratory diagnostic basis for clinical treatment，methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection is the main pathogen in patients.In order to improve the detection accuracy，other detection methods can be combined according to the actual situation to guide drug use.

【Key words】 Loop-mediated isothermal amplification; Sputum culture; Severe pneumonia; Pathogenic bacteria

First-authors address：Meizhou Peoples Hospital，Meizhou 514000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.17.043

重癥肺炎是臨床多發(fā)性疾病，發(fā)病急、進(jìn)展快，以咳嗽、咳痰為主要臨床癥狀，隨著病情加重，甚至出現(xiàn)呼吸衰竭、多器官功能障礙等，具有較高死亡率，多數(shù)患者被確診后將轉(zhuǎn)入重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）救治，而選擇有效抗菌藥物是降低患者死亡率的關(guān)鍵問題[1-2]。但隨著抗生素在臨床治療的廣泛應(yīng)用，耐藥菌株增加將影響患者治療效果，因而需及時(shí)準(zhǔn)確分析病原菌構(gòu)成，準(zhǔn)確判斷病情，給予合理抗生素藥物，從而減少醫(yī)療費(fèi)用，減輕治療痛苦。痰培養(yǎng)是目前普遍應(yīng)用的病原菌檢測技術(shù)，但培養(yǎng)時(shí)間較長，易導(dǎo)致患者錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)，效果欠佳[3]。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）十三聯(lián)檢作為新型檢測技術(shù)，操作簡便快捷，并因敏感度及特異度較好而在病原菌檢測中廣泛應(yīng)用[4]。為探究LAMP檢測技術(shù)在臨床重癥肺炎病原菌檢測價(jià)值，本研究選取87例患者分泌物標(biāo)本分別實(shí)施LAMP十三聯(lián)檢與痰培養(yǎng)檢查并比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1-12月本院收治的87例重癥肺炎患者的分泌物標(biāo)本，包括深部痰液、支氣管吸出物、肺泡灌洗液，其中男61例，女26例，年齡16～89歲，平均（65.84±6.91）歲，均來自ICU，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均經(jīng)胸部影像學(xué)、體溫、血象等檢查確診為重癥肺炎，并符合重癥肺炎感染標(biāo)準(zhǔn)[5];（2）年齡>16歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）心肝腎等嚴(yán)重功能不全;（2）自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病;（3）臨床資料不完整及不配合檢查者。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 LAMP十三聯(lián)檢檢測 收集所有患者分泌物標(biāo)本，并提取標(biāo)本核酸，在65 ℃恒溫條件下利用有鏈置換功能聚合酶進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增，并摻入熒光染料行實(shí)時(shí)熒光檢測，最后利用恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀（北京博奧生物集團(tuán)）及LAMP試劑盒（日本榮研化學(xué)株式會(huì)社）對結(jié)果進(jìn)行分析，十三聯(lián)檢檢測病原菌類型為：（1）肺炎衣原體;（2）肺炎支原體;（3）肺炎鏈球菌;（4）金黃色葡萄球菌;（5）大腸埃希氏菌;（6）肺炎克雷伯菌;（7）銅綠假單胞菌;（8）鮑曼不動(dòng)桿菌;（9）嗜麥芽窄食單胞菌;（10）耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;（11）結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群;（12）流感嗜血桿菌;（13）嗜肺軍團(tuán)菌。并分析不同年齡<20歲、20～60歲、>60歲病原菌檢測情況。

1.2.2 痰培養(yǎng)檢測 根據(jù)《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行標(biāo)本檢測[6]，對無菌接種環(huán)進(jìn)行常規(guī)消毒，待冷卻后將標(biāo)本分別接種中國藍(lán)瓊脂平板（青島海博生物技術(shù)有限公司）、血瓊脂平板及巧克力瓊脂平板（均由英國oxoid公司提供），若有真菌感染接種于念珠菌顯色平板（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）。隨后將平板置入GSP-9080MBE隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（青島正恒試驗(yàn)設(shè)備有限公司）35 ℃，孵化24 h后觀察平板各菌落生長狀況，再取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鑒定，最后應(yīng)用法國梅里埃VITEK 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)檢測各病原菌，以檢出病原菌定義為陽性。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察兩種檢查方法病原菌檢出情況，并對比病原菌檢出陽性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰培養(yǎng)檢查結(jié)果 87例標(biāo)本中痰培養(yǎng)檢查病原菌為22例，陽性率為25.29%，以銅綠假單胞菌（31.82%）為主，均為單一病原菌感染，未檢測出混合細(xì)菌感染，病原菌種類及構(gòu)成比見表1。

2.2 LAMP十三聯(lián)檢檢查結(jié)果 在LAMP十三聯(lián)檢中，87例中陰性標(biāo)本46例（52.87%），陽性標(biāo)本41例（47.13%），其中單一病原菌感染24例（27.59%），混合病原菌感染17例（19.54%），共檢出病原菌10種，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率最高（31.25%，20/64），其次為肺炎克雷伯菌（18.75%，12/64），未檢測出肺炎支原體、嗜麥芽窄食單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌3種病原體。不同年齡段結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中20～60歲、>60歲人群均以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染為主，見表2。

2.3 LAMP十三聯(lián)檢與痰培養(yǎng)檢查結(jié)果比較 87例標(biāo)本中，LAMP十三聯(lián)檢陽性率為47.13%，明顯高于痰培養(yǎng)的25.29%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=8.062，P=0.005）。與LAMP十三聯(lián)檢比較，痰培養(yǎng)未檢測出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、肺炎衣原體及流感嗜血桿菌，但檢測出淺黃假單胞菌及白色假絲酵母菌。

3 討論

多數(shù)重癥肺炎患者需入住ICU治療，局部或全身免疫功能低下，死亡率較高，給社會(huì)及家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來抗生素藥物研究不斷發(fā)展進(jìn)步，但患者死亡率未發(fā)生明顯變化，反而因抗生素濫用使耐藥菌株日益增多，因此明確患者感染病原菌對確立正確治療方案、控制感染、改善預(yù)后具有積極作用[7-8]。病原菌檢測是當(dāng)前診治重癥肺炎有效手段，通過判斷病原菌指導(dǎo)抗生素治療，降低耐藥率。痰培養(yǎng)作為傳統(tǒng)病原菌檢測方法，可為臨床治療提供病原學(xué)依據(jù)，指導(dǎo)用藥，但影響因素較多，若未及時(shí)送檢易導(dǎo)致定植菌死亡或無法檢測需經(jīng)特殊條件培養(yǎng)細(xì)菌，敏感性較差，延誤治療[9-10]。因此，盡早建立高敏感度、高準(zhǔn)確度、便捷高效病原菌檢測方法是臨床診治重癥肺炎亟待解決問題。

隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)不斷發(fā)展進(jìn)步，LAMP作為新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，從在傳統(tǒng)PCR技術(shù)發(fā)展而來，具有較高敏感度、特異度等優(yōu)勢，可應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌、HBV、HIV等疾病檢測中，并獲得國際認(rèn)同，成為成熟且重要的檢測手段[11]。LAMP的4對特異性引物是針對靶基因6個(gè)不同特殊區(qū)域設(shè)計(jì)，因此，若6個(gè)區(qū)域任意一個(gè)與引物間不相匹配將影響核酸擴(kuò)增，具有較高特異度[12]。隨后在高活性鏈置換DNA聚合酶幫助下使鏈置換DNA合成不斷循環(huán)，并在65 ℃左右恒溫條件下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，故其因在恒溫條件下即可進(jìn)行核酸擴(kuò)增，完成相關(guān)反應(yīng)，則不必應(yīng)用熱循環(huán)儀，從而縮短檢測時(shí)間[13-14]。此外，結(jié)果判定簡單便捷，在擴(kuò)增過程中，加入熒光染料，可通過觀察反應(yīng)液顏色對結(jié)果進(jìn)行判讀，無需電泳即可觀察擴(kuò)增效果[15]。因此，LAMP十三聯(lián)檢其儀器設(shè)備成本較低，操作方便，擴(kuò)增速度快，可在30～60 min內(nèi)獲得結(jié)果，更適用于基層檢測，并且病毒擴(kuò)增模板達(dá)致幾個(gè)拷貝。LAMP雖可提高檢測準(zhǔn)確率，但LAMP十三聯(lián)檢容易受污染，并在疾病高發(fā)季節(jié)中，未能建立多通道檢測，且產(chǎn)物克隆、單鏈分離等方面也存在不足，影響檢測結(jié)果，故需醫(yī)師在臨床實(shí)際工作中按步驟嚴(yán)格操作，加強(qiáng)質(zhì)量控制，并結(jié)合實(shí)際情況聯(lián)合其他檢測技術(shù)，提高病原菌檢出率，以控制病情，提高預(yù)防治療效果。

本研究顯示痰培養(yǎng)檢查87例標(biāo)本陽性率為25.29%，以銅綠假單胞菌為主，并檢測出白色假絲酵母菌及淺黃假單胞菌各1例，未發(fā)現(xiàn)混合病原菌感染，而LAMP十三聯(lián)檢顯示陽性率為47.13%，明顯高于痰培養(yǎng)（P<0.05），且檢出混合病原菌感染17例，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、肺炎衣原體及流感嗜血桿菌等病原菌，可見LAMP檢測技術(shù)作為一種新型病原菌檢測技術(shù)更為便捷、準(zhǔn)確，明顯優(yōu)于痰培養(yǎng)，也充分表明其在混合感染檢測中發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢，便于醫(yī)師采取針對性抗菌藥物控制病情，具有臨床推廣應(yīng)用的價(jià)值，但兩種檢測方法各有優(yōu)勢，針對痰培養(yǎng)應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步探究。此外，LAMP檢測顯示患者耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢出率最高，可能因標(biāo)本主要來源于老年人存在密切聯(lián)系。結(jié)果還顯示，不同年齡段結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），可見隨著年齡增長，感染病原菌存在差異性，故臨床進(jìn)行病原菌檢測過程中可考慮年齡因素，提高檢出率。而且20～60歲、>60歲人群均以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染為主，提示該病菌成為患者感染主要致病菌，感染率較高，需引起重視，積極進(jìn)行病原菌檢測，合理使用抗生素，控制病情。

綜上所述，LAMP十三聯(lián)檢可快速檢測病原菌，為臨床治療提供可靠依據(jù)，明顯優(yōu)于痰培養(yǎng)檢測，而且設(shè)備簡單、易操作，可在基層醫(yī)院推廣應(yīng)用。但本研究受納入對象偏少、年齡層次分布不均等因素影響，研究結(jié)果可能有所偏移，后期研究序進(jìn)行大樣本、多中心深入探究，提高患者病原菌檢出效果。

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（收稿日期：2019-03-29） （本文編輯：張爽）