纖維素酶水解小麥秸稈的酶解動力學

王興吉 劉文龍 閆宜江

摘要：小麥秸稈粉末經(jīng)過2%稀NaOH溶液蒸煮預處理后，投入纖維素酶進行水解反應，對水解反應條件進行了優(yōu)化后顯示：小麥秸稈懸浮溶液與纖維素酶混合反應30 h后檢測還原糖含量，當投入纖維素酶量40 U/g，溫度45 ℃，磷酸鹽緩沖液調節(jié)pH值為4.5，小麥秸稈酶解效率最高，達到64.3%;同時試驗證明NaCl和MgSO4對反應有促進作用;纖維素酶水解小麥秸稈的米氏常數(shù)Km和最大反應速度vmax分別為1.175 mg/L和0.221 mg/（h·L）。

關鍵詞：小麥秸稈;預處理;纖維素酶;還原糖

中圖分類號： TQ914.1 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0309-03

我國是世界上秸稈產(chǎn)量最大的國家，年產(chǎn)量近7億t，其中小麥秸稈占總秸稈數(shù)量的一半以上[1]。伴隨糧食豐收之后的大量秸稈的處理一直是每年都要面臨的重要議題，而傳統(tǒng)的焚燒處理不僅造成了資源的浪費，更是對環(huán)境造成了嚴重污染[2]。秸稈作為一種可再生資源，對它合理利用將會產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和環(huán)境效益，具有重大的開發(fā)和研究價值，近年來經(jīng)過研究人員不斷探索，已經(jīng)開發(fā)出飼料添加、造紙原料、無機肥原料、生物發(fā)酵等處理方法[3-4]，這些方法開發(fā)了秸稈利用的新途徑，但是因為應用面狹窄、產(chǎn)值不高等問題，造成只能開發(fā)局部而不能普及于廣大小麥產(chǎn)區(qū)。

近年來隨著酶工程的快速發(fā)展，纖維素酶已經(jīng)能夠工業(yè)化大量生產(chǎn)，這為小麥秸稈的深層次開發(fā)提供了一種重要工具。纖維素酶作為一種復合酶，能夠將小麥秸稈中的主要成分纖維素水解為還原糖[5]。通過水解反應，1 t纖維素完全水解后可生產(chǎn)1.1 t葡萄糖，而糖作為一種基礎生物化工原料，廣泛應用于發(fā)酵、有機合成、食品添加、飼料添加等行業(yè)，是一種高附加值的原料。通過纖維素酶催化水解小麥秸稈，具有條件溫和、反應高效、產(chǎn)物價值高等特點，證明該生物轉化方法是一種環(huán)保經(jīng)濟的處理方法，具有廣闊的應用前景[6]。

未經(jīng)處理的小麥秸稈中纖維素的含量約為39.31%，經(jīng)過一定處理后，能夠提高纖維素的相對含量達到50%以上[7]。使用稀堿溶液蒸煮粉碎的秸稈，能夠有效地破壞木質素和半纖維素等物質對纖維素的保護作用，并且對纖維素結晶也具有疏松作用，處理后增大了纖維素與酶的接觸面積，更加有利于反應效率的提高。本試驗將預處理的纖維素作為底物與纖維素酶混合進行反應，通過檢測還原糖的含量來監(jiān)測反應的進行程度，并且對反應條件進行初步優(yōu)化，進一步提高了纖維素酶的水解效率[8]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑材料 纖維素酶由龍科特酶制劑工程有限公司生產(chǎn)，為棕黃色液體。小麥秸稈產(chǎn)自山東省沂水縣附近農(nóng)村，NaOH、磷酸鹽、鹽酸以及其他實驗室常用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設備

SHA-C恒溫振蕩器（常州電器有限公司），721可見光分光光度計（上海菁華科技儀器公司）。

1.3 方法

1.3.1 秸稈預處理 稱取1 kg正常曬干的秸稈磨粉后過100目篩，稱取100 g秸稈粉末浸入250 mL 1.5% NaOH溶液中，加熱煮沸處理30 min，冷卻至室溫后鹽酸調節(jié)至中性，3 000 r/min 離心清洗3次，沉淀烘干備用。

根據(jù)纖維素的水解化學式：（C6H10O5）n+nH2O→nC6H12O6 得出：

秸稈中纖維素含量=（還原糖質量×0.909）/秸稈質量×100%。

1.3.2 纖維素水解反應 準確稱取4 g纖維素粉末，煮沸浸泡30 min冷卻后與100 U纖維素酶溶液混合定容至100 mL。反應溫度通過恒溫水浴搖床控制在40 ℃，pH值通過磷酸緩沖鹽調節(jié)為5.0。每4 h取樣1次，檢測還原糖含量。

1.3.3 還原糖和酶活的測定 采用DNS法[9]檢測糖含量。由于纖維素酶為復合酶，難以統(tǒng)一檢測酶活，所以本試驗采用最后產(chǎn)物還原糖的糖化率來表示酶活力。同時為了更清晰地作出對比，將同一時間點的最高酶活力作為100%參照，采用相對酶活力表示。

糖化率=（還原糖質量×0.909）/添加秸稈中纖維素質量×100%[10]。

2 結果與分析

2.1 添加酶量對反應的影響

在同一條件下，分別添加10、20、30、40、50、60、70、80 U酶量，10 h后檢測還原糖含量。由圖1可知，隨著添加酶量的增加，相同時間段內還原糖的產(chǎn)量有不同幅度增加，當酶量為40 U后繼續(xù)增大酶添加量，還原糖產(chǎn)量增加緩慢，增加至 60 U 后幾乎不再增大產(chǎn)率，說明在該條件下，酶含量已經(jīng)趨近飽和。為了避免造成酶的浪費，節(jié)省開支，同時達到最大的生產(chǎn)效率，40 U單位酶量是最佳添加量。

2.2 纖維素酶水解小麥秸稈反應進程

纖維素酶與小麥秸稈懸浮液混合反應，每隔4 h取樣檢測還原糖含量。結果表明：反應92 h后，還原糖含量不再發(fā)生明顯變化，認為在該條件下，小麥秸稈中的纖維素反應完全，糖化率為100%，繼續(xù)反應至102 h后，檢測還原糖的產(chǎn)量為2.173 g，根據(jù)纖維素和還原糖的反應比例關系，該反應完全水解了1.975 g纖維素， 則本批次預處理小麥秸稈粉末的纖維素含量為49.4%。由圖2可知，在40 h前反應速度較為恒定，可以看做零級反應，所以選擇40 h前的時間段作為酶動力學檢測時間，為了減小誤差，選擇30 h作為反應檢測終點[11]。

2.3 溫度和pH值對纖維素酶水解秸稈纖維的影響

在溫度20、25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃梯度，檢測不同溫度對纖維素酶水解小麥秸稈纖維活性的影響。反應30 h后檢測產(chǎn)物還原糖含量，結果（圖3-a）顯示，隨著溫度的升高，還原糖的含量不斷升高，反應溫度為45 ℃時酶活最高，溫度繼續(xù)升高酶活降低，反應溫度提高至60 ℃以后，酶活降低至50%以下，已經(jīng)不能達到反應要求的效率。本次使用的纖維素酶，在自然pH值條件下，常溫條件儲存3 d后酶活力仍然保持84%，在4 ℃低溫條件下儲存10 d，酶活力保持80%以上，說明該酶的溫度穩(wěn)定性較高，不易失活。

在最適溫度45 ℃條件下，選擇pH值3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0梯度，反應30 h后檢測還原糖含量，結果顯示，在較低pH值范圍內酶活較低，隨著pH值的升高，酶活逐漸增大，在pH值4～6.5范圍內酶活保持70%以上，在pH值為4.5時，酶活達到最大，之后酶活開始逐漸降低（圖3-b），說明該纖維素復合酶為偏酸性酶，同時最佳反應pH值為4.5。該酶在室溫pH值3～6的條件下儲存5 d，酶活力保持在80%以上，在堿性條件下保存2 d，酶活損失60%，恢復最適pH值后不能恢復酶活，證明酶在堿性條件下易變性失活。

2.4 金屬離子對纖維素酶水解秸稈纖維的影響

本試驗對各類金屬離子不同濃度對纖維素酶水解小麥秸稈的影響進行了對比。以不添加金屬離子的反應作為100%對照，結果如表1所示。Na+和Mg2+不同的濃度對纖維素酶水解小麥秸稈都有促進作用，5 mmol/L時促進作用最明顯，Cu2+對酶活有抑制作用，這是由于重金屬離子使蛋白質變性失活，抑制了反應的進行[12]。試驗數(shù)據(jù)顯示，試驗中其他金屬離子對酶活影響較小。

2.5 纖維素酶動力學

在上述最優(yōu)條件下，測定不同底物濃度下的反應初速率，分別以底物濃度的倒數(shù)1/[S]為橫坐標，反應初速率的倒數(shù)1/v 為縱坐標作圖，得反應初速率與底物濃度的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)擬合曲線[13]。由圖4可知，纖維素酶水解小麥秸稈的米氏常數(shù)Km和vmax分別為1.175 mg/L和 0.221 mg/（h·L）。

3 結論與討論

本次試驗中，小麥秸稈經(jīng)過稀堿蒸煮預處理后，能夠被纖維素酶完全水解的纖維素含量為49.4%，仍然有大量木質素或結晶狀態(tài)的纖維素存在，影響纖維素的糖化率[14]。經(jīng)過條件優(yōu)化，本次采用的纖維素酶水解小麥秸稈生產(chǎn)還原糖的最佳反應條件為溫度45 ℃、pH值4.5，而且該酸性纖維素酶具有較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，反應進行中適量的Na+和Mg2+會促進反應的進行，而重金屬離子使纖維素酶失活，抑制反應進行。本試驗各項條件優(yōu)化結果為酶水解小麥秸稈提供了應用基礎。

后續(xù)工作中，需要繼續(xù)進行小麥秸稈的預處理進行優(yōu)化，提高纖維素的相對含量，充分破壞纖維素的結晶結構，有利于秸稈中纖維素與纖維素酶的充分接觸反應。

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