植物乳桿菌對(duì)卷煙品質(zhì)的影響

米其利 楊娟 徐玉瓊

摘要：為了提升煙葉品質(zhì)，從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸蘿卜中分離篩選到1株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）L15。將菌體懸液發(fā)酵煙絲以及對(duì)發(fā)酵產(chǎn)香條件進(jìn)行優(yōu)化，感官評(píng)吸結(jié)果表明，L15處理能有效提升煙葉的香氣，降低卷煙的雜氣、苦辣味和刺激性，改善余味，突顯酸香味;最佳產(chǎn)香條件為：接菌量1×109 CFU/mL、發(fā)酵溫度37 ℃、菌齡20 h，煙葉產(chǎn)地貴州福泉。發(fā)酵后煙絲主要化學(xué)成分比例更加平衡。致香成分分析表明，L15發(fā)酵使化合物數(shù)量從46個(gè)減少至42個(gè)，含量變化較大的化合物有乙酸、3-甲基丁醛和2-己酮。表明植物乳桿菌L15能有效改善煙葉的內(nèi)在質(zhì)量，提升卷煙抽吸品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌;陳化;卷煙品質(zhì);致香成分

中圖分類號(hào)： TS44+4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0177-04

煙葉陳化是在一定溫度和濕度條件下，煙葉理化特性發(fā)生深刻變化，煙葉香氣、色澤和吸味品質(zhì)明顯改善的一個(gè)重要卷煙生產(chǎn)加工過程。煙葉陳化分為自然陳化和人工陳化。人工陳化速度快，但發(fā)酵后煙葉內(nèi)各種成分比例不協(xié)調(diào)，至今已經(jīng)很少采用。自然陳化發(fā)酵效果好，但耗時(shí)長(zhǎng)，場(chǎng)地占用大，資金積壓多，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高。在煙葉的陳化過程中，微生物扮演著重要角色。Reid等率先發(fā)現(xiàn)，雪茄煙葉表面存在大量細(xì)菌、霉菌[1]。朱大恒等從中國烤煙煙葉中成功分離到大量微生物，包括占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌、少量放線菌和真菌[2]。目前，隨著高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于煙草行業(yè)，陳化煙葉表面更多微生物種類得到了鑒定[3-4]。

煙葉表面存在的復(fù)雜微生物群落不僅可以加速煙葉發(fā)酵，還可以降低煙葉中有害成分，如煙堿、亞硝胺等[5-6]，以及改善和提高煙葉的吸食品質(zhì)[7-9]，所以在煙葉陳化過程中添加外源微生物進(jìn)行發(fā)酵，以便快速改善煙葉品質(zhì)是煙草科技開發(fā)的重要課題。Izquierdo等在19世紀(jì)60—70年代發(fā)現(xiàn)，利用單種或多種微生物發(fā)酵煙葉，能使煙葉的香氣質(zhì)得到顯著改善[10-11]。黃靜文等發(fā)現(xiàn)，經(jīng)短小芽孢桿菌（Bacillus pumilum）發(fā)酵后的煙葉，煙香增加，刺激性降低，卷煙吸食味顯著改善[12]。陳興等發(fā)現(xiàn)，西姆芽孢桿菌（B. siamensis）能有效改善煙葉內(nèi)在質(zhì)量，提升卷煙抽吸品質(zhì)[13]。此外，利用微生物發(fā)酵液改善煙葉品質(zhì)和香氣的報(bào)道較多。李雪梅等利用微生物菌株Nic22的發(fā)酵上清液處理煙葉，結(jié)果表明，處理后卷煙的雜氣和刺激性減輕，抽吸品質(zhì)顯著提高[14]。

乳酸菌是公認(rèn)的食品級(jí)安全微生物，廣泛應(yīng)用于酸奶、果汁、饅頭等食品的風(fēng)味塑造。目前，用于煙葉發(fā)酵的微生物大多分離自煙葉表面或土壤，有些是條件致病菌[4]，存在一定的安全隱患。食源性有益菌用于煙葉發(fā)酵的報(bào)道不多，而利用乳酸菌改善煙葉品質(zhì)的報(bào)道較少。甄達(dá)文等在制備煙用香料時(shí)發(fā)現(xiàn)，煙葉碎片經(jīng)酶處理以后，用德氏乳酸菌（Lactobacillus debrueckii）和生香酵母組合發(fā)酵制得的香料，增香效果明顯[15]。潘家華等研究表明，由植物乳桿菌（L. plantarum）和醋酸桿菌（Clostriolium themoacidophilus）組成的復(fù)合微生物制劑發(fā)酵煙葉后，卷煙的陳化酸香和柔和細(xì)膩煙氣均增加，刺激性降低，吸食口感變好[16]。

本研究從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品酸蘿卜中篩選到1株植物乳桿菌，將其菌懸液用于煙葉發(fā)酵，優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)香條件，并檢測(cè)發(fā)酵對(duì)煙葉化學(xué)成分和致香成分的影響，為利用食品級(jí)乳酸菌改善煙葉品質(zhì)，提升卷煙吸食質(zhì)量及塑造新型風(fēng)味卷煙等方面提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 煙葉 由云南中煙有限責(zé)任公司原料部提供，品種為K326，在倉庫中已自然陳化1年。

1.1.2 MRS培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L、牛肉粉8 g/L、酵母粉 4 g/L、葡萄糖20 g/L、吐溫80 1 mL/L、K2HPO4 2 g/L，NaAc 5 g/L、MgSO4 0.2 g/L、MnSO4 0.5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L，pH值6.2，滅菌條件為115 ℃，20 min。如需配成固體，在液體培養(yǎng)基中添加15 g/L瓊脂。

1.1.3 改良MRS固體培養(yǎng)基 MRS液體培養(yǎng)基中添加 10 g/L CaCO3、0.4 g/L溴甲酚紫和15 g/L瓊脂。

1.1.4 煙葉培養(yǎng)基 將1年陳化齡煙葉研磨成粉末，在 100 mL 培養(yǎng)基中加入0.8 g煙葉粉末和1.5 g瓊脂，115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，用于篩選以煙葉為唯一營養(yǎng)源的乳酸菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離與鑒定 從湖南懷化采集酸蘿卜樣品若干份，利用改良MRS固體培養(yǎng)基篩選乳酸菌，單菌落保存在-80 ℃冰箱中。隨機(jī)選取6株乳酸菌，在煙葉培養(yǎng)基中劃線分離，37 ℃培養(yǎng)48 h。將長(zhǎng)勢(shì)最好的1株乳酸菌在MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)，并按照常規(guī)細(xì)菌鑒定方法[17]進(jìn)行生理生化特性分析。利用細(xì)菌基因組提取試劑盒（百泰克，中國）提取L15基因組DNA，用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增L15 16S rDNA基因，并送往昆明碩擎生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，32個(gè)循環(huán);72 ℃ 6 min。序列信息提交至NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行在線比對(duì)分析。綜合形態(tài)、生理生化和分子鑒定結(jié)果確定菌株身份。

1.2.2 菌株生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線 從-80 ℃冰箱中取出菌株保藏液，按0.4%（體積比）接種至5 mL MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化?；罨玫木喊?.4%（體積比）接種于100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)40 h。每隔2 h取4 mL菌液，用于D600 nm、pH值測(cè)定和活菌數(shù)分析。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 煙絲發(fā)酵和發(fā)酵條件優(yōu)化 用切絲機(jī)將煙葉切成煙絲，稱取含水率為12%的煙絲30 g，噴施6 mL濃度為1.0×109 CFU/mL、菌齡為20 h的乳酸菌菌懸液，對(duì)照樣品噴施等量無菌水。將處理后的煙絲和對(duì)照裝入無菌食品袋中，于溫度為37 ℃、60%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d。然后，將煙絲制成卷煙，用于后續(xù)感官評(píng)吸。為獲得最佳發(fā)酵條件，基于感官評(píng)吸，通過正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 感官評(píng)吸 將發(fā)酵卷煙和對(duì)照隨機(jī)編號(hào)，在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中平衡24 h后，由6名專家進(jìn)行評(píng)吸。卷煙感官質(zhì)量用香氣質(zhì)、香氣量、濃度、勁頭、刺激性、余味、雜氣量、燃燒性和灰色等9個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，得分越高，抽吸品質(zhì)越好。每個(gè)樣品重復(fù)評(píng)吸3次。

1.2.5 主要常規(guī)化學(xué)成分測(cè)定 采用連續(xù)流動(dòng)分析法，參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T 159—2002、YC/T 468—2013、YC/T 468—2013，分別測(cè)定總糖含量、還原糖含量、總氮含量、總植物堿含量。

1.2.6 揮發(fā)性成分分析 利用頂空-固相微萃取技術(shù)分離揮發(fā)性化合物，每次萃取的煙樣為0.5 g，溫度為60 ℃，時(shí)間為40 min。氣相色譜條件：色譜柱為DB-WAXetr型毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）（Agilent，美國）;程序升溫為初始溫度60 ℃，保持5 min，第1階升溫速率2 ℃/min，終溫 200 ℃，第2階升溫速率10 ℃/min，終溫240 ℃，保持 10 min;進(jìn)樣口溫度180 ℃;載氣為高純氦氣;恒流模式，柱流量1.5 mL/min，分流比10 ∶ 1。質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊源;電離能量70 eV;傳輸線溫度180 ℃;離子源溫度 200 ℃;溶劑延遲4 min;質(zhì)量范圍33～400 amu。對(duì)采集到的質(zhì)譜圖利用Wiley和NIST譜庫進(jìn)行串聯(lián)檢索，確定化合物身份，并利用峰面積歸一化法計(jì)算各化學(xué)成分在樣品中的相對(duì)含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌篩選和鑒定

在改良MRS固體平板上，菌落顏色為乳白色或淡黃色，菌落周圍有明顯溶鈣圈，溴甲酚紫變?yōu)辄S色，這些單菌落初步確定為乳酸菌。在6株乳酸菌中，4株能在煙葉固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，將長(zhǎng)勢(shì)最好1株命名為L(zhǎng)15，作為后續(xù)試驗(yàn)菌株。L15菌落形態(tài)規(guī)則，淡黃色，表面光滑、邊緣整齊;菌株顯微形態(tài)為短桿狀、無鞭毛。生理生化測(cè)定結(jié)果見表1。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果顯示，L15與L. plantarum 16S rDNA序列具有>99%同源性。形態(tài)、生理生化和分子鑒定結(jié)果表明，L15為植物乳桿菌。

2.2 菌株L15生長(zhǎng)和產(chǎn)酸特性

生長(zhǎng)曲線分析顯示，L15從4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在18 h進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，30 h后菌落數(shù)和D600 nm值開始下降，推測(cè)其可能開始進(jìn)入衰亡期（圖1）。產(chǎn)酸曲線分析發(fā)現(xiàn)，在最初接菌到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期pH值維持6左右，然后在對(duì)數(shù)期急劇下降，最后從對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末期到衰亡期維持在3.4～3.5（圖1），說明L15具有很強(qiáng)的產(chǎn)酸能力。

2.3 感官評(píng)吸

按照試驗(yàn)方法所述進(jìn)行感官評(píng)吸，試驗(yàn)結(jié)果，L15處理能顯著改善卷煙吸食品質(zhì)，表現(xiàn)為對(duì)照樣品的煙氣質(zhì)粗糙，雜氣大，刺激感凸顯，余味苦辣，化學(xué)味較強(qiáng)，而L15發(fā)酵卷煙的香氣質(zhì)提升，煙氣柔和，雜氣、刺激性和苦辣味減輕，酸香味凸顯，余味改善。在總評(píng)分為50分情況下，發(fā)酵卷煙的分值為32.39分，明顯高于對(duì)照的29.33分。

2.4 產(chǎn)香發(fā)酵條件優(yōu)化

基于感官評(píng)吸，對(duì)L15發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。選取接菌量、發(fā)酵溫度、菌齡、煙葉產(chǎn)地4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)[L8（3×23）]（表2）。正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。從表3可以看出，接菌量為1×109 CFU/mL、發(fā)酵溫度為37 ℃、菌齡為20 h、煙葉產(chǎn)地為貴州福泉時(shí)，發(fā)酵卷煙的感官評(píng)吸值最高，分別比未優(yōu)化和對(duì)照高0.42、3.48分，表明A2B2C2D2組合為L(zhǎng)15的最適產(chǎn)香發(fā)酵條件。

2.5 煙絲主要常規(guī)化學(xué)成分分析

經(jīng)L15處理后，煙絲中的總氮含量、總植物堿含量變化不明顯，但總糖含量極顯著降低，總還原糖含量顯著減少，導(dǎo)致糖氮比由10.11降低至9.29，糖堿比由9.16降低至8.63（表4）。

2.6 致香成分分析

從表5可以看出，L15發(fā)酵卷煙致香成分的種類主要包括酸、酮、醛、醇等4個(gè)大類，它們的含量均超過了10%。從化合物的種類來看，對(duì)照樣品共鑒定出46個(gè)揮發(fā)性化合物，包括4個(gè)酸、13個(gè)酮、9個(gè)醛、8個(gè)醇、2個(gè)酯、2個(gè)烯、2個(gè)苯、2個(gè)呋喃、4個(gè)其他揮發(fā)性化合物，L15發(fā)酵卷煙對(duì)應(yīng)揮發(fā)性化合物數(shù)量分別為5個(gè)酸、14個(gè)酮、9個(gè)醛、6個(gè)醇、1個(gè)酯、烯和苯為0、2個(gè)呋喃和5個(gè)其他揮發(fā)性化合物。從化合物的含量來看，總酸、總醇和總酯含量增加，總?cè)?、總酮、總烯、總苯和總呋喃含量減少;含量較多且變化很明顯的化合物有乙酸、3-甲基丁醛和2-己酮，其中乙酸含量增加了18.5百分點(diǎn)，3-甲基丁醛含量減少了10.96百分點(diǎn)，2-己酮從7.33%減少為0。另外，有些化合物，例如丙酸、5-甲基呋喃醛、2-甲基呋喃等，它們的含量雖然較少，但處理與對(duì)照煙樣間存在顯著性差異。這些化合物的改變可能是L15改善煙葉吸食品質(zhì)的主要原因。

3 討論與結(jié)論

在煙葉陳化過程中，添加外源微生物進(jìn)行發(fā)酵，能減輕卷煙雜氣和刺激性，提高吃香味，改善煙葉品質(zhì)[9-11，17]。本研究結(jié)果，即植物乳桿菌L15發(fā)酵處理后的卷煙，香氣質(zhì)提升，煙氣柔和，雜氣、刺激性和苦辣味減弱，酸香味凸顯，余味改善，說明植物乳桿菌能改善煙葉吸食品質(zhì)。由于乳酸菌的安全性，利用乳酸菌塑造特征風(fēng)格卷煙潛力巨大。

煙葉化學(xué)成分是卷煙吸食味的物質(zhì)基礎(chǔ)。微生物發(fā)酵會(huì)加速煙葉化學(xué)成分變化，縮短陳化時(shí)間。瞿嬌嬌等發(fā)現(xiàn)，食源性芽孢桿菌能明顯改善煙葉品質(zhì)，發(fā)酵處理后煙葉的總糖含量、糖氮比、糖堿比均下降[18]，本研究結(jié)果與其高度相似。由于乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌，L15處理造成總糖含量、總還原糖含量減低應(yīng)該歸因于L15發(fā)酵產(chǎn)酸。L15發(fā)酵引起主要化合物含量的改變，可能使煙葉的糖、氮和堿等比值更趨于平衡，促進(jìn)煙葉品質(zhì)改善。

通過發(fā)酵，煙絲中致香物質(zhì)種類由46個(gè)減少至42個(gè)，這些含量從無到有或從有到無的化合物，除了2-己酮外，含量均很少。發(fā)酵后煙絲的總酸含量尤其是乙酸含量、總醇含量和總酯含量增加，總?cè)┖坑绕涫?-甲基丁醛含量、總酮含量尤其是2-己酮含量、總烯含量、總苯含量、總呋喃含量減少，說明在L15的作用下，煙葉中的化合物可能進(jìn)行了相互轉(zhuǎn)化。酸類致香物質(zhì)能去除雜氣，改善口感，減輕刺激，醇類致香物質(zhì)使卷煙香氣細(xì)膩，酯類致香物質(zhì)能掩蓋焦苦氣息，改善煙氣吸味[19-20]。這些致香物質(zhì)含量變化可能是L15發(fā)酵卷煙吸食品味高于對(duì)照的重要原因之一。但煙葉品質(zhì)的高低是多種因素綜合作用的結(jié)果，L15改善卷煙品質(zhì)的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究闡明。

參考文獻(xiàn)：

[1]Reid J J，Haley E E. Studies on the fermentation of tobacco Ⅰ. The microflora of cured and fermenting cigar-leaf tobacco[J]. Pennsylvania Agricultural Experiment Station Bulletin，1933，356：1-17.

[2]朱大恒，陳 銳，陳再根，等. 烤煙自然醇化與人工發(fā)酵過程中微生物變化及其與酶活性關(guān)系的研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2001，7（2）：26-30.

[3]Ye J，Yan J，Zhang Z，et al. The effects of threshing and redrying on bacterial communities that inhabit the surface of tobacco leaves[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2017，101（10）：4279-4287.

[4]Chopyk J，Chattopadhyay S，Kulkarni P，et al. Mentholation affects? the cigarette microbiota by selecting for bacteria resistant to harsh environmental conditions and selecting against potential bacterial pathogens[J]. Microbiome，2017，5（1）：22.

[5]Gong X W，Yang J K，Duan Y Q，et al. Isolation and characterization of Rhodococcus sp. Y22 and its potential application to tobacco processing[J]. Research in Microbiology，2009，160（3）：200-204.

[6]Wei X，Deng X，Cai D，et al. Decreased tobacco-specific nitrosamines by microbial treatment with Bacillus amyloliquefaciens DA9 during the air-curing process of burley tobacco[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（52）：12701-12706.

[7]Maldonado-Robledo G，Rodriguez-Bustamante E，Sanchez-Contreras A，et al. Production of tobacco aroma from lutein. Specific role of the microorganisms involved in the process[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2003，62（5/6）：484-488.

[8]Rodríguez-Bustamante E，Maldonado-Robledo G，Ortiz M A，et al. Bioconversion of lutein using a microbial mixture-maximizing the production of tobacco aroma compounds by manipulation of culture medium[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2005，68（2）：174-182.

[9]趙銘欽，李曉強(qiáng). 煙葉微生物發(fā)酵機(jī)理及生物制劑應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（6）：84-91.

[10]Izquierdo T A. Bacteria in tobacco fermentation[J]. Coresta，1958（2）：2146.

[11]English C F，Bell E J，Berger A J. Isolation of thermophiles from broadleaf tobacco and effect of pure culture inoculation on cigar aroma and mildness[J]. Applied Microbiology，1967，15（1）：117-119.

[12]黃靜文，段焰青，者 為，等. 短小芽孢桿菌改善煙葉品質(zhì)的研究[J]. 煙草科技，2010，43（8）：61-64.

[13]陳 興，張?zhí)鞐?，黨立志，等. 利用西姆芽孢桿菌改善煙葉品質(zhì)的研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，30（2）： ?322-327.

[14]李雪梅，楊偉祖，祝明亮，等. 煙堿降解菌的選育及改善上部煙葉品質(zhì)研究[J]. 工業(yè)微生物，2006，36（1）：16-22.

[15]甄達(dá)文，于鐵妹，朱珊珊，等. 利用酶法與微生物發(fā)酵法制備天然煙用香料[J]. 食品工業(yè)科技，2009，30（12）：268-272.

[16]潘家華，黃 龍，龐登紅. 加速煙葉陳化和提升煙葉品質(zhì)的復(fù)合微生物制劑及其應(yīng)用：CN103202533A[P]. 2013-07-17.

[17]東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社，2001.

[18]瞿嬌嬌，施 鳴，張慶明，等. 食品微生物對(duì)發(fā)酵煙葉品質(zhì)的影響[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（3）：136-138.

[19]黃靜文，段焰青，楊金奎，等. 煙葉主要致香成分和煙葉等級(jí)以及醇化時(shí)間的對(duì)比分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（3）：440-445.

[20]王 濤，張 強(qiáng)，吳雨松，等. 云南省煙梗微波膨脹后致香物質(zhì)差異性分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，56（14）：2694-2699.