不同陳化時(shí)間廣陳皮表面細(xì)菌和真菌多樣性變化分析

楊放晴,何麗英,楊丹,申夢園,王福,劉友平,胡媛

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,四川 成都,611137)

廣陳皮為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑的干燥成熟果皮[1],有理氣健脾、燥濕化痰之功效。其藥用歷史悠久,是嶺南地區(qū)著名道地中藥材[2]。同時(shí)可制成陳皮茶、飲料、添加劑和香料等,具有很高的食用價(jià)值[3]。傳統(tǒng)理論認(rèn)為陳皮“陳久者良”[4],現(xiàn)代主要從不同貯藏年限的陳皮化學(xué)成分變化、藥理作用的強(qiáng)弱比較等方面對(duì)其進(jìn)行探討,而對(duì)陳皮陳化機(jī)理的現(xiàn)代研究相對(duì)薄弱[5-6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),陳皮中黃酮類成分的增長與藥材貯藏過程中表面污染真菌黑曲霉等的代謝活動(dòng)相關(guān)[7]。相關(guān)文獻(xiàn)也報(bào)道微生物參與了陳皮的陳化過程,能夠轉(zhuǎn)化陳皮中化合物從而使活性物質(zhì)含量增加[8]。

既往基于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法對(duì)廣陳皮中微生物多樣性進(jìn)行研究,但廣陳皮中微生物菌群種類繁多,采用傳統(tǒng)的方法無法檢測出所有微生物,導(dǎo)致低估了菌群數(shù)量和多樣性[9]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和測序成本的降低,高通量測序技術(shù)越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[10]。如陳聰聰[11]對(duì)3個(gè)不同產(chǎn)地的廣陳皮進(jìn)行高通量分子測序,發(fā)現(xiàn)廣陳皮表面存在大量的Bacillus、Pseudomonas、Lactococcus、Enterococcus、Mycobacterium、Arthrobacter；何靜[12]對(duì)不同產(chǎn)地陳皮表面細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)主要分布有Bacillus、Pseudomonas、Sphingomonas、Methylobacterium、Acinetobacter、Enhydrobacter、Enterobacter;劉麗娜[8]研究4個(gè)不同年份廣陳皮表面微生物群落多樣性,能準(zhǔn)確檢測到的細(xì)菌屬有Pseudomonas、Sphingomonas、Methylobacterium、Lactobacillus等,檢測到的真菌屬有Xeromyces、Alternaria、Symmetrospora、Xerochrysium、Cladosporium、Mortierella、Pleurotus、Chaetomium、Gibberella；張鑫等[13]分析了不同產(chǎn)地陳皮表面真菌群落多樣性,發(fā)現(xiàn)主要優(yōu)勢真菌是Erythrobasidium、Penicillium、Aspergillus、Rhodotorula和Mycosphaerella。不同學(xué)者研究結(jié)果不太一致,究其原因是由于這些研究實(shí)驗(yàn)材料不一。但未見對(duì)陳化過程中陳皮表面細(xì)菌、真菌結(jié)構(gòu)的分析報(bào)道。

本研究首次采用高通量測序技術(shù)對(duì)固定采收地點(diǎn)、采樣地點(diǎn)、果樹樹齡、貯藏養(yǎng)護(hù)條件下,陳化1～5年的廣陳皮表面微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化進(jìn)行分析,以期揭示廣陳皮陳化過程中微生物群落變化特征及變化規(guī)律,為適合陳皮陳化微生物的篩選提供基礎(chǔ),同時(shí)為后續(xù)優(yōu)勢功能菌的分離篩選,深入研究廣陳皮陳化機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 廣陳皮樣品的收集

于廣東省江門市新會(huì)區(qū)三江鎮(zhèn)新馬單村收集陳化1、2、3、4、5年的廣陳皮樣品(均在同一環(huán)境下貯存)各1批,編號(hào)依次為Y1～Y5。采集后迅速保存于-80 ℃。實(shí)驗(yàn)所用樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授鑒定為蕓香科植物橘的栽培變種茶枝柑(Citrusreticulatacv. ‘Chachi’)的干燥成熟果皮。

1.2 主要試劑和儀器

SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DZX-50KBS型立式高壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；GeneJET 膠回收試劑盒,Thermo Scientific公司；Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer、高效高保真酶,New England Biolabs 公司；Bio-rad T100 梯度 PCR 儀,美國Bio-rad公司；TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒、NovaSeq 6000測序系統(tǒng),Illumina公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取

用棉簽在廣陳皮表面擦拭多次,擦拭面積5 cm×5 cm共計(jì)用20支棉簽。擦拭后,將棉簽部分剪下。采用CTAB法提取基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度,取適量樣品入離心管,使用無菌水稀釋樣品至10- 6g/L[13]。

1.3.2 PCR擴(kuò)增與測序

以稀釋后的基因組DNA為模板,根據(jù)測序區(qū)域的選擇,使用帶Barcode的特異引物。細(xì)菌主要針對(duì)16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,引物為515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)[14]。真菌擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镮TS1區(qū),引物為ITS1-1F-F (CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS1-1F-R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)[14]。使用Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR,確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性[15]。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：Phusion Master Mix(2×)15 μL,正反引物(2 μmol/L)各 1.5 μL,gDNA(1 mg/L)10 μL,ddH2O 2 μL。細(xì)菌PCR 反應(yīng)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。真菌PCR 反應(yīng)參數(shù)：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s,35個(gè)循環(huán)；56 ℃ 30 s；72 ℃ 15 s；72 ℃ 7 min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的混樣和純化

PCR產(chǎn)物使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣,充分混勻后使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物,割膠回收目標(biāo)條帶并用膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶。

1.3.4 文庫構(gòu)建和上機(jī)測序

使用Illumina 公司的TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit定量和文庫檢測合格后,用NovaSeq 6000 測序系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

去除Barcode序列和引物序列,使用FLASH v1.2.7軟件進(jìn)行拼接,得到原始Tags 數(shù)據(jù)(raw tags)。Raw tags進(jìn)行嚴(yán)格的過濾處理[16]后參照QIIME v1.9.1[17]的Tags質(zhì)量控制流程,與物種注釋數(shù)據(jù)庫比對(duì)剔除嵌合體,得到有效序列。利用UPARSE v7.0.1001軟件[18]以97%的一致性將序列聚類為操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)。16S：用MOTHUR方法與SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定比對(duì)閾值為0.8～1)[19]。ITS：用QIIME軟件中的BLAST方法與Unit數(shù)據(jù)庫對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋分析。獲得分類學(xué)信息,對(duì)各個(gè)分類水平上的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過QIIME軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析。利用R軟件v2.15.3進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析及繪制主成分分析(principal component analysis,PCA)圖。利用LEfSe軟件對(duì)樣品進(jìn)行線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)。

2 結(jié)果分析

2.1 樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

對(duì)不同陳化時(shí)間廣陳皮樣品進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性測序分析質(zhì)控后細(xì)菌共得到1 790 539條有效數(shù)據(jù),對(duì)有效序列進(jìn)行聚類,以97%的一致性將序列聚類為OTUs,共得到可分類OTUs數(shù)目約為90 033個(gè),范圍為1 769～3 616。真菌共得到1 997 205條有效數(shù)據(jù),以97%的一致性將序列聚類為OTUs,累計(jì)得到可分類OTUs數(shù)目約為7 886個(gè),范圍在126～435。

2.2 不同陳化時(shí)間廣陳皮表面微生物多樣性分析

Alpha 多樣性用于分析樣品內(nèi)微生物群落豐富度和多樣性。常用的分析指數(shù)包括Shannon、Simpson、Chao1、ACE和Coverage[20]。其中ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)表示群落物種豐富度,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)表示群落多樣性,Coverage指數(shù)表征測序得到的物種覆蓋率[21]。樣本中細(xì)菌的覆蓋率均在0.977以上,真菌覆蓋率均在0.999以上,表明測序深度均已覆蓋到測試樣本中的大部分物種,具有可靠的數(shù)據(jù)質(zhì)量。

不同陳化時(shí)間廣陳皮表面細(xì)菌的Shannon、Chao1指數(shù)相對(duì)真菌而言普遍較大,說明廣陳皮陳化過程中細(xì)菌的物種總數(shù)和種類多于真菌。在表1中,陳化2年樣品具有最高的Shannon指數(shù)(7.67)和Chaol指數(shù)(3 632),此時(shí)細(xì)菌物種總量最高,群落組成最復(fù)雜。再者,Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)在5年陳皮樣品中數(shù)值最低,分別為5.78和2 082,明顯低于其余樣品。說明在廣陳皮陳化過程中細(xì)菌的物種總數(shù)和種類呈降低趨勢,細(xì)菌物種趨向單一化。

表1 不同陳化時(shí)間廣陳皮表面細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)(n=6)

對(duì)于真菌,由表2可知,陳化3年樣品具有最高的Shannon指數(shù)(4.14)和Chao1指數(shù)(439),此時(shí)真菌物種總量最高,群落組成最復(fù)雜。Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)在2年陳皮樣品中數(shù)值最低,分別為0.93和129,低于其余樣品。在廣陳皮陳化過程中,真菌的Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)變化趨勢沒有細(xì)菌明顯,但總體上呈降低趨勢。具體見圖1。

表2 不同陳化時(shí)間廣陳皮表面真菌 Alpha 多樣性指數(shù)(n=6)

圖1 不同陳化時(shí)間廣陳皮表面細(xì)菌和真菌群落多樣性(Shannon)及相對(duì)豐度(Chao 1)分析**P<0.01

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)組成及其動(dòng)態(tài)變化

2.3.1 不同陳化時(shí)間廣陳皮微生物門水平群落組成特征

不同陳化時(shí)間廣陳皮門水平細(xì)菌群落組成如圖2-a所示,Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Cyanobacteria等為優(yōu)勢細(xì)菌。Proteobacteria為廣陳皮陳化過程中的絕對(duì)優(yōu)勢菌門,不同陳化時(shí)間廣陳皮所有樣本相對(duì)豐度均在70%以上。Firmicutes隨陳化時(shí)間的增加相對(duì)豐度總體呈增長趨勢,并在陳化2年時(shí)相對(duì)豐度最高(10.22%)。Cyanobacteria 在廣陳皮陳化過程中相對(duì)豐度呈波動(dòng)變化(0.77%～6.22%)。Actinobacteria隨陳化時(shí)間的增加總體呈降低趨勢,在陳化1年時(shí)相對(duì)豐度最高(7.21%),說明Actinobacteria的細(xì)菌較少或基本沒有參與陳皮陳化過程。根據(jù)高通量測序結(jié)果,在門的分類水平上,不同陳化時(shí)間廣陳皮樣品間細(xì)菌群落組成基本一致。

不同陳化時(shí)間廣陳皮門水平真菌群落組成如圖2-b所示,Ascomycota、Basidiomycota等為優(yōu)勢真菌。Ascomycota為陳化1～5年廣陳皮中主要優(yōu)勢真菌,相對(duì)豐度分別為62.17%、8.89%、46.11%、86.06%和52.13%。其次為Basidiomycota,相對(duì)豐度分別為13.13%、1.3%、17.94%、0.57%和1.49%。不同陳化時(shí)間廣陳皮中真菌群落結(jié)構(gòu)一致,只是不同陳化時(shí)間廣陳皮的群落組成比例有差異。

圖2 門水平上細(xì)菌(a)及真菌(b)樣本的群落組成分析

2.3.2 不同陳化時(shí)間廣陳皮微生物屬水平群落組成

由圖3-a可知,在細(xì)菌屬水平上,主要分布為unidentified_Rickettsiales、Phyllobacterium、Methylobacterium、unidentified_Cyanobacteria、Pseudomonas、Sphingomonas、Stenotrophomonas、Lactococcus、Bacillus等。在已知細(xì)菌中,Phyllobacterium、Stenotrophomonas在陳化1～4年時(shí)相對(duì)豐度呈增加趨勢,在陳化4年相對(duì)豐度最高,分別為19.58%和10.21%,至陳化5年迅速下降。Pseudomonas隨陳化時(shí)間的增加相對(duì)豐度總體呈增加趨勢,在陳化4年時(shí)相對(duì)豐度最大(13.02%)。Methylobacterium隨陳化時(shí)間增加相對(duì)豐度總體呈降低趨勢,在陳化1年時(shí)相對(duì)豐度最高,為19.56%。Sphingomonas、Bacillus在陳化過程中相對(duì)豐度皆呈波動(dòng)變化,其波動(dòng)范圍分別在3.04%～7.02%、0.71%～1.24%。Lactococcus僅在陳化5年的廣陳皮樣本中存在,其相對(duì)豐度為3.14%。值得關(guān)注的是,陳皮表面Methylobacterium、Pseudomonas、Sphingomonas、Stenotrophomonas、Lactococcus、Bacillus與多種揮發(fā)油相關(guān)[11-12]；在對(duì)煙葉微生物結(jié)構(gòu)多樣性分析中發(fā)現(xiàn),Pseudomonas、Sphingomonas、Stenotrophomonas為廣泛分布的優(yōu)勢細(xì)菌屬[22]。煙葉陳化過程中,菌屬間呈此消彼長的關(guān)系,細(xì)菌優(yōu)勢功能菌群變化與化學(xué)成分逐級(jí)降解間呈顯著相關(guān)[23],能夠有效降低煙葉中尼古丁等有害成分的含量[24],增加煙葉香氣[25]。

在真菌屬水平上,主要包括Xeromyces、Cladosporium、Zasmidium、Symmetrospora、Aureobasidium、Fusarium、Aspergillus等(圖3-b)。其中Xeromyces在廣陳皮陳化過程中相對(duì)豐度總體呈增長趨勢,陳化4年時(shí)相對(duì)豐度最高(49.72%)。Zasmidium、Fusarium在陳化1年時(shí)相對(duì)豐度最高,分別為22.58%和11.53%,隨陳化時(shí)間的增加,相對(duì)豐度迅速下降,至陳化5年時(shí)豐度一直較低,說明Zasmidium、Fusarium的真菌菌落較少或基本沒有參與陳皮陳化過程；Cladosporium、Symmetrospora、Aureobasidium在陳化1年和3年樣本中相對(duì)豐度較高,其中Cladosporium、Aureobasidium在陳化3年豐度最高,分別為13.78%、8.48%,Symmetrospora在陳化1年豐度最高(10.87%)。Aspergillus在陳化3年豐度最高,為0.92%。值得注意的是,本課題組前期在陳皮表面鑒定出Aspergillusniger、Aspergillusflavus、Aspergillusfumigatus3種真菌,屬于Aspergillus。可見Aspergillus在陳皮中檢出率較高。Aspergillus雖是陳皮在陳化過程中常見的致病菌和霉菌,但大量文獻(xiàn)報(bào)道[7-8,26]Aspergillusniger等真菌廣泛應(yīng)用于微生物轉(zhuǎn)化,影響陳皮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的變化。

2.4 不同陳化時(shí)間廣陳皮樣本微生物屬水平豐度聚類分析

選取豐度排名前35的細(xì)菌屬和真菌屬,根據(jù)每個(gè)樣本各屬的豐度均值,分別對(duì)樣本之間細(xì)菌、真菌相對(duì)豐度進(jìn)行聚類分析,得到熱圖。熱圖可以通過板塊顏色的相似性及差異性來反映多個(gè)樣本在各分類水平上群落組成,這樣能直觀地比較分析不同樣本在同一個(gè)分類學(xué)水平上的的異同[27]。將細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)熱圖(圖4-a)中Z>1的物種定為優(yōu)勢細(xì)菌屬,繪制成表(表3)。結(jié)合表3和圖4-a可知,Methylobacterium,Sphingomonas等在陳化1年樣本中聚集較多；Bacillus,Lysinibacillus等在陳化2年樣本中分布最為豐富；Rickettsia,Craurococcus等主要分布在陳化3年樣本中；Phyllobacterium,Pseudomonas等分布在陳化4年的樣本；Pantoea,Lactococcus等在陳化5年時(shí)分布較多。

表3 不同陳化時(shí)間廣陳皮表面優(yōu)勢細(xì)菌屬分布情況

將真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)熱圖(圖4-b)中Z>1的物種定為優(yōu)勢真菌屬,繪制成表(表4)。結(jié)合表4和圖4-b可知,Zasmidium,Cladosporium等在陳化1年樣本中聚集較多；Rhodotorula在陳化2年樣本中分布最為豐富；Cladosporium,Aureobasidium等主要分布在陳化3年樣本中；Xeromyces,Xerochrysium分布在陳化4年的樣本；Gibellulopsis,Erythrobasidium在陳化5年時(shí)分布較多。

a-屬水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)熱圖；b-屬水平上真菌群落結(jié)構(gòu)熱圖

表4 不同陳化時(shí)間廣陳皮表面優(yōu)勢真菌屬分布情況

2.5 不同陳化時(shí)間廣陳皮物種組成相似度分析

應(yīng)用PCA分析對(duì)不同陳化時(shí)間廣陳皮樣品物種組成相似度進(jìn)行評(píng)價(jià),若樣品的物種組成越相似,則在PCA圖中距離越相近。對(duì)不同陳化時(shí)間廣陳皮樣本進(jìn)行屬水平上細(xì)菌的PCA分析,研究細(xì)菌樣本的相似性和差異性。結(jié)果顯示第1主坐標(biāo)(PC1)和第2主坐標(biāo)(PC2)分別解釋65.08%和12.02%的群體遺傳變異。PCA分析結(jié)果顯示,陳化5年的樣本距離其他樣本較遠(yuǎn),說明陳化5年的樣本群落組成與其他樣本相比具有一定的菌群差異(圖5-a)。對(duì)不同陳化時(shí)間廣陳皮樣本進(jìn)行屬水平上真菌的PCA分析,第1主坐標(biāo)(PC1)和第2主坐標(biāo)(PC2)分別占所有差異的44.13%和38.69%。根據(jù)距離遠(yuǎn)近,陳化1年與陳化3年品的距離較小,物種組成相似。陳化2、4、5年樣本間距離較小,物種組成接近(圖5-b)。

a-細(xì)菌樣本；b-真菌樣本

2.6 不同陳化時(shí)間廣陳皮微生物差異物種分析

LEfSe分析能夠在組與組之間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker,柱狀圖種展示了LDA Score>4的物種,即組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。柱狀圖的長度代表差異物種的影響大小。在柱狀圖中,分析了不同陳化時(shí)間廣陳皮表面由門至屬(或種)分類級(jí)別的微生物。由圖6-a可知,陳化1年廣陳皮中細(xì)菌豐度差異顯著的物種有3種,主要是Rhizobiales、Beijerinckiaceae、Methylobacterium；陳化2年時(shí)細(xì)菌差異顯著物種主要是unidentified Gammaproteobacteria；陳化3年細(xì)菌差異顯著物種主要是Rickettsiaceae、Rickettsia等7種；陳化4年為Rhizobiaceae、Gammaproteobacteria等11種。陳化5年為unidentified Rickettsiales、Rickettsiales 等16種。可以看出在陳化5年廣陳皮中細(xì)菌差異顯著物種最多。

由圖6-b可知,陳化1年廣陳皮中真菌豐度差異顯著的物種有15種,主要是Dothideomycetes、Capnodiales、Mycosphaerellaceae、Zasmidium等；陳化3年時(shí)真菌差異顯著物種主要為Basidiomycota、Cystobasidiomycetes等9種；陳化4年真菌顯著差異物種主要是Eurotiales、Eurotiomycetes、Aspergillaceae等6種?？梢钥闯鲈陉惢?年廣陳皮中真菌差異顯著物種最多。

a-細(xì)菌樣本；b-真菌樣本

3 結(jié)論

既往報(bào)道主要在陳皮表面致病菌的分離鑒定和生物學(xué)特征上,對(duì)陳化過程中微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化研究鮮有報(bào)道。結(jié)合歷代本草對(duì)于陳皮陳化時(shí)間“隔年”、“2、3年”記載和地理標(biāo)志產(chǎn)品新會(huì)陳皮規(guī)定自然陳化3年以上者才為陳皮,該實(shí)驗(yàn)首次通過高通量測序技術(shù)對(duì)固定采收地點(diǎn)、采樣地點(diǎn)、果樹樹齡、貯藏養(yǎng)護(hù)等條件陳化1～5年的廣陳皮表面微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化進(jìn)行研究。

結(jié)果表明不同陳化時(shí)間廣陳皮樣本表面細(xì)菌、真菌組成結(jié)構(gòu)基本一致,但相對(duì)豐度差異明顯,優(yōu)勢菌屬不同。Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria、Cyanobacteria是不同陳化時(shí)間廣陳皮表面主要優(yōu)勢細(xì)菌菌門。細(xì)菌屬水平上,主要分布有unidentified_Rickettsiales、Phyllobacteriu、Methylobacterium、unidentified_Cyanobacteria、Pseudomonas、Sphingomonas、Stenotrophomonas、Lactococcus、Bacillus。隨陳化時(shí)間的增加,從以Methylobacterium、Sphingomonas為優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)橐訠acillus,Pseudomonas,Stenotrophomonas,Lactococcus為主。就真菌而言,Ascomycota、Basidiomycota是不同陳化時(shí)間廣陳皮表面主要優(yōu)勢真菌菌門。真菌屬水平上,主要分布有Xeromyces、Cladosporium、Zasmidium、Symmetrospora、Aureobasidium、Fusarium、Aspergillus。隨陳化時(shí)間的增加,從以Zasmidium、Cladosporium、Symmetrospora、Fusarium為優(yōu)勢轉(zhuǎn)變?yōu)橐訡ladosporium、Aureobasidium、Aspergillus、Xeromyces為主。

本實(shí)驗(yàn)通過高通量測序技術(shù),不僅全面揭示參與廣陳皮自然陳化過程中的微生物群落及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,并檢測出不同陳化時(shí)間廣陳皮表面優(yōu)勢菌屬,為后續(xù)優(yōu)勢功能菌的分離篩選及探究陳皮陳化機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。陳皮陳化對(duì)提升陳皮質(zhì)量至關(guān)重要,然而陳皮自然陳化過程時(shí)間長、成本高。目前,利用微生物轉(zhuǎn)化增加有效成分,改善品質(zhì)研究較為廣泛。因此可以在明確陳皮陳化機(jī)理后可以探索是否有“人工催陳”方法來縮短陳化時(shí)間、減少經(jīng)濟(jì)的損失、資源的浪費(fèi)[5]。