紅曲菌9901利用柚子囊固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K

劉曉寧,錢高飛,傅曼瓊,付杰,戴海民,張薄博*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214000)2(汕頭大學(xué) 理學(xué)院,廣東 汕頭,515063)3(廣東柚通柚美農(nóng)產(chǎn)品技術(shù)研究有限公司,廣東 梅州,514000)

紅曲菌是一種具有悠久應(yīng)用歷史的藥食兩用絲狀真菌,發(fā)酵后能產(chǎn)生天然色素和多種具有生理活性的次生代謝產(chǎn)物,包括Monacolin K、γ-氨基丁酸、多糖等[1]。Monacolin K 對(duì)膽固醇合成限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A,HMG-CoA)具有高效抑制作用,從而具有抑制膽固醇合成,控制高血脂的功效[2-3]。與從其他菌類提取或人工合成的洛伐他汀相比,紅曲產(chǎn)品中的Monacolin K結(jié)晶少、溶解度高,因而對(duì)心血管疾病的療效更顯著,毒副作用更小[4-5]。但是微生物產(chǎn)Monacolin K常用谷物類基質(zhì)生產(chǎn)成本較高，不適合工業(yè)生產(chǎn)。

食品副產(chǎn)物作為發(fā)酵基質(zhì),用于菌體或微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)已有多年歷史。為了能夠降低生產(chǎn)成本,提高食品副產(chǎn)物的利用價(jià)值,目前已有以黃精渣[6]、甘蔗渣[7]、沙棘籽粕[8]、米糠[9]、豆粕[10]、麥麩[11]等作為培養(yǎng)基,進(jìn)行紅曲固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K的研究。吳雙雙[9]通過采用紫外-化學(xué)誘變育種,與添加營養(yǎng)物質(zhì)相結(jié)合的方式來發(fā)酵米糠,生產(chǎn)Monacolin K,產(chǎn)量最高達(dá)到11.68 g/kg,說明食品副產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K有較大的發(fā)展空間。本課題組在以大米[12]和小米[13]等谷物為原料,進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的研究方面已取得了較好的結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，本研究選取幾種具有高值化潛力的食品副產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對(duì)比了紅曲菌固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K的產(chǎn)量，確定以柚子囊作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，探究不同發(fā)酵條件對(duì)紅曲菌9901產(chǎn)Monacolin K的影響，并對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

紅色紅曲菌9901,江南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,pH自然,121 ℃滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60,魚粉蛋白胨25,NaNO32,MgSO4·7H2O 1,K2HPO4·3H2O 1,玉米漿粉6,500 mL錐形瓶裝液量100 mL,pH值調(diào)至6.0,121 ℃滅菌20 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：食品副產(chǎn)物類基質(zhì)干質(zhì)量為10 g,培養(yǎng)基初始含水量45%,pH自然,121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑

洛伐他汀(純度98%)。甲醇、乙腈(純度99.9%)。葡萄糖、魚粉蛋白胨、NaNO3、MgSO4·7H2O、K2HPO4、玉米粉、(NH4)2SO4、甘油、乳糖、瓊脂、無水乙醇、酵母膏、蔗糖、麥芽糖,以上為分析純。柚子囊,由大埔縣通美實(shí)業(yè)有限公司提供,土豆、陳皮、麥糟、麩皮、香菇腿、橘子核均為市售。

1.2 儀器與設(shè)備

A11型超高速粉碎儀,廣州艾卡儀器設(shè)備有限公司；HYG-A型全溫?fù)u床柜,太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；SW-CJ-IF型超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司；FA-1004FA型電子天平,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-B11-360型電熱恒溫培養(yǎng)箱,連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠；LDZX-40B1型高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；MB 45型水分活度儀,美國奧豪斯公司；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵,鞏義市予華儀器有限公司；KQ-100型超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司；PB-10型pH儀,季爾國際貿(mào)易上海有限公司；1525型高效液相色譜儀,美國Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 紅曲菌9901利用食品副產(chǎn)物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的工藝

將在4 ℃冰箱保藏的紅曲菌9901,放在28 ℃培養(yǎng)箱活化1 d后,用無菌水將菌種孢子從斜面洗脫下來,制成孢子濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液,接種10 mL的孢子懸浮液,于100 mL液態(tài)種子培養(yǎng)基中。置于30 ℃恒溫恒濕的搖床內(nèi),以180 r/min,培養(yǎng)2 d,之后將種子培養(yǎng)液以不同接種量,接種至固態(tài)培養(yǎng)基,放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱以30 ℃,培養(yǎng)2 d后以25 ℃培養(yǎng)不同時(shí)間。發(fā)酵完成后烘干,用高效液相色譜法檢測(cè)Monacolin K的含量。

1.3.2 紅曲菌9901利用食品副產(chǎn)物固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.2.1 不同食品副產(chǎn)物對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

分別取干重為10 g的柚子囊、陳皮、麥糟、麩皮、香菇腿、橘子核作為食品副產(chǎn)物固態(tài)基質(zhì),液體種子以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有上述基質(zhì)的100 mL發(fā)酵瓶中,初始含水量為45%；30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)2 d；然后25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)至18 d。發(fā)酵完成后檢測(cè)Monacolin K的含量。

1.3.2.2 初始含水量對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態(tài)種子,以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發(fā)酵瓶中,調(diào)節(jié)初始含水量分別為40%、45%、50%、55%、60%、65%,30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)2 d；然后25 ℃條發(fā)酵培養(yǎng)至18 d。發(fā)酵完成后檢測(cè)Monacolin K的含量。

1.3.2.3 接種量對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態(tài)種子,分別以5%、10%、15%、20%、25%、30%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發(fā)酵瓶中,調(diào)節(jié)初始含水量為45%。30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)2 d；然后25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)至18 d。發(fā)酵完成后檢測(cè)Monacolin K的含量。

1.3.2.4 外加碳源類型對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態(tài)種子,以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發(fā)酵瓶中,調(diào)節(jié)初始含水量為45%。額外添加碳源,種類分別為甘油、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖,添加量為總質(zhì)量的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)2 d；然后25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)至18 d。發(fā)酵完成后檢測(cè)Monacolin K的含量。

1.3.2.5 乳糖添加量對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態(tài)種子,以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發(fā)酵瓶中,調(diào)節(jié)初始含水量為45%。額外添加乳糖,添加量分別為總質(zhì)量的1%、3%、5%、7%、9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)2 d；然后25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)至18 d。發(fā)酵完成后檢測(cè)Monacolin K的含量。

1.3.2.6 外加氮源類型對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

將紅色紅曲菌9901的液態(tài)種子,以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發(fā)酵瓶中,調(diào)節(jié)初始含水量為45%。添加的氮源分別為硫酸銨、硝酸鈉、玉米粉、酵母膏、蛋白胨,添加量為總質(zhì)量的2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)2 d；然后25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)至18 d。發(fā)酵完成后檢測(cè)Monacolin K的含量。

1.3.2.7 發(fā)酵時(shí)間對(duì)Monacolin K產(chǎn)量的影響

將紅色紅曲菌9901的液體種子,分別以10%(mL∶g)的接種量,接入裝有干重為10 g柚子囊的100 mL發(fā)酵瓶中,初始含水量為45%,30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)2 d；25 ℃條件下,分別檢測(cè)發(fā)酵12、14、16、18、20、22、24 d時(shí)Monacolin K的含量。

1.3.2.8 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

為進(jìn)一步研究變量之間交互作用的影響關(guān)系,使用響應(yīng)面分析法篩選最佳發(fā)酵條件。每個(gè)單因素的初步研究是響應(yīng)面優(yōu)化的指導(dǎo)范圍,基于Box-Behnken采樣原理,選擇對(duì)Monacolin K含量有影響的3個(gè)因素：初始含水量A、乳糖添加量B、接種量C進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.3.3 Monacolin K含量檢測(cè)方法

1.3.3.1 液相色譜檢測(cè)條件

儀器：Waters 2487；色譜柱型號(hào),20 RBA×SB-C18；流動(dòng)相V(乙腈)∶V(水)=55∶45,磷酸調(diào)pH值至2.5；流速1.5 mL/min,柱溫30 ℃；檢測(cè)器,紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長238 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3.2 內(nèi)酯型Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品4.0 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至10 mL,超聲,使溶液完全溶解,得到400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液,分別配制質(zhì)量濃度為10、25、50、80、100、150、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾后,通過高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)峰面積與Monacolin K濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制出內(nèi)酯型Monacolin K的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.3.3 酸型Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取內(nèi)酯型Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg,置于10 mL容量瓶中,用0.1 mol/L的NaOH(用50%的乙腈配制)溶液定容至10 mL,得到200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液,于50 ℃水浴1 h,超聲1 h,用1 mol/L的HCl調(diào)pH至中性。

將標(biāo)準(zhǔn)母液逐級(jí)稀釋后得到質(zhì)量濃度為10、25、50、80、100、150、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,經(jīng)0.22 μm的有機(jī)濾膜過濾后,通過高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定,根據(jù)峰面積與Monacolin K濃度的對(duì)應(yīng)關(guān)系,以濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制出酸型Monacolin K的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.3.4 樣品的測(cè)定

將紅曲菌利用固態(tài)食品副產(chǎn)物發(fā)酵結(jié)束的產(chǎn)品,放于45 ℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干,之后用研磨機(jī)打碎至粉末狀,將每份樣品的粉末混勻,并過100目篩子,取0.5 g樣品于50 mL比色管中,用70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇定容至50 mL,55 ℃水浴1 h,每20 min振蕩1次,水浴結(jié)束后冷卻至室溫,靜置后過0.22 μm有機(jī)濾膜,通過高效液相色譜測(cè)定。根據(jù)內(nèi)酯型Monacolin K和酸型Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Monacolin K總含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以HPLC測(cè)得的內(nèi)酯式Monacolin K峰面積為縱坐標(biāo),以內(nèi)酯式Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),用Origin擬合,經(jīng)計(jì)算得到內(nèi)酯式Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.723 2x+0.578 9。試驗(yàn)表明內(nèi)酯式Monacolin K質(zhì)量濃度在0～200 mg/L,具有良好的線性關(guān)系。

以HPLC測(cè)得的酸式Monacolin K峰面積為縱坐標(biāo),以酸式Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo),用Origin擬合,經(jīng)計(jì)算得到酸式Monacolin K標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.753 97x+0.178 67。試驗(yàn)表明酸式Monacolin K質(zhì)量濃度在0～200 mg/L,具有良好的線性關(guān)系。

2.2 食品副產(chǎn)物固態(tài)基質(zhì)的確定

不同的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)、密度、通氣性能以及比表面積,對(duì)微生物的生長環(huán)境及傳質(zhì)、傳熱造成很大影響[14-15]。故選取有發(fā)酵潛力的食品副產(chǎn)物作為基質(zhì)進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,對(duì)紅色紅曲菌9901發(fā)酵產(chǎn)Monaconlin K的能力進(jìn)行檢測(cè),考察不同食品副產(chǎn)物固態(tài)基質(zhì)對(duì)Monaconlin K產(chǎn)量的影響,如圖1所示。

圖1 食品副產(chǎn)物種類對(duì)紅色紅曲菌9901產(chǎn)Monacolin K的影響

在所選的食品副產(chǎn)物固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中,Monacolin K的產(chǎn)量,由高到低的排列順序?yàn)椋鸿肿幽?麩皮>麥糟>橘子核>香菇腿>陳皮。Monacolin K產(chǎn)量最高的為柚子囊,產(chǎn)量平均可達(dá)6 187.9 mg/kg。Monacolin K產(chǎn)量最低的為陳皮,產(chǎn)量僅有1 763.6 mg/kg。用柚子囊作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)Monacolin K產(chǎn)量,是以陳皮作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)時(shí)Monacolin K產(chǎn)量的3.5倍。柚子囊是一種多孔的介質(zhì),同時(shí)其本身具有一定營養(yǎng)成分(總糖含量9.3%,蛋白質(zhì)含量1.7%),因此可以提供適宜紅曲菌生長的條件,用于紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K。

2.3 基質(zhì)初始含水量的確定

固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)的水分含量一般在40%～60%[16],過高或者過低均不利于菌絲生長以及次級(jí)代謝的正常進(jìn)行[17-18]。因此調(diào)節(jié)不同的初始含水量,來研究初始含水量對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的影響。由表2可知,隨著初始含水量的增加,紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的產(chǎn)量先增加后減少。初始含水量過多過少時(shí)均不利于Monacolin K的生產(chǎn),可能是由于當(dāng)含水量過高時(shí),基質(zhì)間的氧傳遞不足,且易出現(xiàn)結(jié)團(tuán)現(xiàn)象,菌絲無法深入基質(zhì)內(nèi)部生長,因此營養(yǎng)利用不充分。而當(dāng)含水量過低時(shí),雖基質(zhì)松散,但基質(zhì)內(nèi)部未被水滲透,從而菌體不易生長到柚子囊內(nèi)部。初始含水量為45%時(shí),發(fā)酵產(chǎn)物中Monacolin K含量最高達(dá)到最高。因此,采用初始含水量為45%的條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 初始含水量對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的影響

2.4 接種量的確定

接種量會(huì)直接影響菌體生長進(jìn)而影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成,因此研究了接種量對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的影響。由圖2可知,隨著接種量的增加,發(fā)酵產(chǎn)物中Monacolin K含量先升高后降低,當(dāng)接種量為10%時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物中Monacolin K含量最高。這是因?yàn)榻臃N量太少菌體生長較慢,但過大的接種量會(huì)使菌體生長過快,營養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗,同樣不利于Monacolin K的合成。因此選取10%(mL∶g)的接種量,作為紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的最適接種量。

圖2 接種量對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的影響

2.5 外加碳源類型的確定

碳源是構(gòu)成菌體和產(chǎn)物的碳架及其能量來源,不同的碳源種類會(huì)影響Monacolin K的產(chǎn)量,參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[19-23],本試驗(yàn)選用以下5種碳源進(jìn)行比較：乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖。由圖3可知,添加不同的碳源種類對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K有較大差異。通過實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象觀察,額外添加葡萄糖的實(shí)驗(yàn)組中,菌絲體的生長較其他實(shí)驗(yàn)組更快更多。葡萄糖是最易利用的碳源,從而使得更多的營養(yǎng)物質(zhì)用于菌體生長,反而不利于后期Monacolin K的積累。添加乳糖、甘油、蔗糖、麥芽糖的實(shí)驗(yàn)組,菌絲體適度生長,發(fā)酵后期能正常積累Monacolin K。添加乳糖后,紅曲菌9901生產(chǎn)Monacolin K的含量最高,因此乳糖為紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的最適外加碳源。

圖3 碳源類型對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的影響

2.6 乳糖添加量的確定

由于碳源是紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)生Monacolin K的限制性底物,碳源含量是決定細(xì)胞生長和產(chǎn)物積累量的主要因素之一。由圖4可知,隨著乳糖質(zhì)量濃度的逐漸增加,Monacolin K的產(chǎn)量不斷增加。乳糖在添加量為占總質(zhì)量的3%時(shí),紅曲菌9901生產(chǎn)Monacolin K的含量最高。當(dāng)乳糖添加量繼續(xù)增加時(shí),菌體細(xì)胞滲透壓不斷增大,會(huì)對(duì)菌絲體代謝產(chǎn)物的合成及氧的傳遞過程造成較大影響[24],Monacolin K的產(chǎn)量不斷降低。從Monacolin K的產(chǎn)量和原料利用率等因素綜合考慮,選擇占總質(zhì)量的3%的乳糖,作為紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的最適碳源添加量。

圖4 乳糖添加量對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的影響

2.7 外加氮源類型的確定

氮源不足會(huì)導(dǎo)致菌體生長緩慢,氮源過多,則微生物生長過于旺盛,不利于代謝產(chǎn)物的積累。本試驗(yàn)選取了5種常見的碳源：NaNO3、蛋白胨、酵母膏、(NH4)2SO4、玉米粉進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。由圖5可知,對(duì)照組的含量最高,不需要添加氮源,即可生產(chǎn)出較多的Monacolin K,從優(yōu)化發(fā)酵工藝、降低成本等方面來考慮,選擇不額外添加碳源,進(jìn)行紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 氮源類型對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的影響

2.8 發(fā)酵時(shí)間的確定

紅曲菌固態(tài)發(fā)酵使用不同的菌株,不同的培養(yǎng)方式,產(chǎn)Monacolin K的周期不同[23,25],且固態(tài)發(fā)酵周期較長。為確定紅色紅曲菌9901利用柚子囊發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的最佳時(shí)間,進(jìn)行了發(fā)酵時(shí)間的確定實(shí)驗(yàn)。由圖6可知,從第12～18天,隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,Monacolin K的含量迅速增加,Monacolin K開始大量積累。發(fā)酵20 d時(shí),Monacolin K積累速度減緩,產(chǎn)量達(dá)到最大。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加,而22 d時(shí),Monacolin K的含量開始有所下降,可能是固態(tài)發(fā)酵后期,培養(yǎng)基基質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗完畢,菌體已經(jīng)不能合成Monacolin K,而且Monacolin K開始分解造成的。因此,紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵柚子囊的發(fā)酵周期選為20 d。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K 的影響

2.9 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果及分析

根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理和單因素試驗(yàn)的結(jié)果,選取初始含水量、乳糖添加量及接種量作為自變量,設(shè)計(jì)了3因素3水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。以Monacolin K產(chǎn)量作為考核指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),相關(guān)的設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert 10.0.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得到紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=6 804.58+691.26A-81.605B-511.123C+1 093.58AB+246.885AC-453.99BC-1 547.22A2-873.719B2-837.394C2

表4 響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

各因素之間的交互作用,對(duì)紅曲菌9901利用柚子囊發(fā)酵生產(chǎn)Monacolin K的影響,可以通過多元回歸方程所作的三維空間的曲面圖及等高線圖直觀的反映出來[26]。從圖7中3個(gè)響應(yīng)面圖,可以看出曲面最高點(diǎn)均在響應(yīng)面上,故各因素的最優(yōu)水平在所選范圍之內(nèi)。各因素對(duì)Monacolin K產(chǎn)量影響越大,其響應(yīng)面圖越為陡峭,從以上結(jié)果可以看出,A(初始含水量)、B(接種量)對(duì)紅色紅曲菌9901固態(tài)發(fā)酵柚子囊生產(chǎn)的Monacolin K積累量影響更大。結(jié)合表3、表4可以看出,實(shí)驗(yàn)所選的3種因素均具有很好的交互作用,且交互作用的強(qiáng)弱分別為：AB>AC>BC。為進(jìn)一步準(zhǔn)確確定全局最優(yōu)解,以最大化Monacolin K含量為優(yōu)化目標(biāo),根據(jù)Design-Expert 10.0.1 軟件運(yùn)行結(jié)果,Monacolin K含量在初始含水量A、乳糖添加量B、接種量C的共同影響下的最優(yōu)工藝為：初始含水量A為46.4%、乳糖添加量B為3.4%、接種量C為8.5%,在此條件下模型預(yù)測(cè)的最大Monacolin K含量為6 970.8 mg/kg。按照此條件進(jìn)行驗(yàn)證,Monacolin K 產(chǎn)量達(dá)到6 984.9 mg/kg。與模型預(yù)測(cè)結(jié)果基本吻合,說明該模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值具有良好的擬合性。

a-乳糖添加量和初始含水量的3D圖；b-接種量和初始含水量的3D圖；c-接種量和乳糖添加量的3D圖；d-乳糖添加量和初始含水量的等高線圖；e-接種量和初始含水量的等高線圖；f-接種量和乳糖添加量的等高線圖

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以具有降脂功效的Monacolin K為目標(biāo)產(chǎn)物,通過對(duì)不同的食品副產(chǎn)物固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行篩選,最終選擇了柚子囊作為固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)。并確定紅曲菌9901利用柚子囊固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)Monacolin K的最佳發(fā)酵條件為：初始含水量A為46.4%、乳糖添加量B為3.4%、接種量C為8.5%,在30 ℃培養(yǎng)2 d后,變溫到25 ℃培養(yǎng)至22 d,Monacolin K的產(chǎn)量可達(dá)6 984.9 mg/kg。

本實(shí)驗(yàn)使用常見的食品副產(chǎn)物,原料易得且價(jià)格低；固態(tài)發(fā)酵對(duì)設(shè)備要求低、能耗低、水消耗量少、無污染、無廢料產(chǎn)生；發(fā)酵產(chǎn)物無需復(fù)雜的提取分離過程,可全部利用,進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本,對(duì)柚子產(chǎn)業(yè)深加工和開發(fā)下游的柚子系列產(chǎn)品都具有重要的指導(dǎo)意義。