低溫脅迫下外源SOD對(duì)枇杷幼果抗寒性的影響

靳瑞萍 王化坤 王彤

摘要：以8年生白玉枇杷為試材，將不同濃度的聚天冬氨酸錳（MSOD）于2017年2月20日（低溫前1 d）均勻噴施于幼果表面，之后測(cè)定相關(guān)抗寒指標(biāo)，以判斷MSOD對(duì)提高枇杷幼果抗寒性的作用效果。結(jié)果表明，在低溫脅迫下，隨著MSOD濃度的增加，枇杷幼果的相對(duì)電導(dǎo)率先升高后降低，丙二醛含量先減少后增加，脯氨酸含量先增加后減少，抗氧化酶（超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶）活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且12.5 mg/L MSOD處理對(duì)枇杷幼果抗氧化物作用效果最明顯。說(shuō)明在低溫脅迫下對(duì)枇杷幼果適當(dāng)施加MSOD，有利于提高其抗寒性。

關(guān)鍵詞：枇杷幼果;聚天冬氨酸錳;低溫脅迫;抗寒性;抗氧化酶

中圖分類號(hào)： S667.301;Q945.78 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0138-04

枇杷（Eriobotrya japonica）屬薔薇科（Rosaceae）枇杷屬（Eriobotrya），原產(chǎn)于中國(guó)亞熱帶，為常綠小喬木，秋冬開花，果實(shí)初夏成熟，是我國(guó)南方的特色水果之一，已成為當(dāng)?shù)刂匾闹еa(chǎn)業(yè)[1]。研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫常引起植物膜脂過(guò)氧化，細(xì)胞膜透性增大，抗氧化酶系統(tǒng)工作異常，造成植物生理障礙，代謝發(fā)生失調(diào)從而導(dǎo)致大量減產(chǎn)，尤以熱帶亞熱帶地區(qū)受害嚴(yán)重[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由此導(dǎo)致全球作物減產(chǎn)高達(dá)50%以上[3]。2008年，我國(guó)南方罕見的長(zhǎng)期低溫、暴雪天氣以及霜凍給枇杷生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重的影響，特別是枇杷栽培的北緣地區(qū)[4]。而全國(guó)唯一的白沙枇杷商品生產(chǎn)基地——江蘇太湖洞庭東山、西山恰處于北緣地區(qū)，其中白玉枇杷為當(dāng)前主推品種之一。相對(duì)枇杷葉片和花而言，幼果更易受凍，常表現(xiàn)為種子受凍致死，特別是直徑為1 cm左右的幼果更易受低溫傷害[5-6]。這些研究充分說(shuō)明了提高枇杷幼果抗寒性的重要性和必要性。

植物的抗寒性及其抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量的關(guān)系密切[7-8]。早在1973年，Lyons就提出了著名的植物冷害的“膜傷害假說(shuō)”[9]。1984年，林植芳等提到植物抗氧化系統(tǒng)平衡及植物膜系統(tǒng)的平衡決定植物抗寒能力的強(qiáng)弱[10]。1991年，曾韶西等也表明相同觀點(diǎn)[11]。聚天冬氨酸錳（poly aspartic manganese，MSOD）是外源SOD的一種模擬化合物，具有高效性和穩(wěn)定性，合成簡(jiǎn)單，可以增強(qiáng)植物抵御逆境的能力，已成為農(nóng)業(yè)抗逆性研究熱點(diǎn)[12]。該產(chǎn)品被用于油菜[13]、菠菜[14]等抗逆研究，效果顯著。但就枇杷的抗寒性方面，施加外源SOD的研究尚鮮見報(bào)道。本研究以低溫脅迫下不同濃度的MSOD對(duì)8年生白玉枇杷幼果若干生理生化指標(biāo)的影響為主要研究?jī)?nèi)容，旨在為提高枇杷的抗寒性提供理論參考，為枇杷商品優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2017年2月20—28日，在江蘇省太湖常綠果樹技術(shù)推廣中心進(jìn)行。該中心位于江蘇省蘇州市吳中區(qū)東山鎮(zhèn)（又稱洞庭東山），介于31°00′～31°07′N、120°20′～120°27′E 之間，屬亞熱帶濕潤(rùn)氣候型，降雨量多而不均，無(wú)霜期年平均長(zhǎng)達(dá)233 d，冬季較短，而春季災(zāi)害頻發(fā)，如低溫、寒潮、暴雨等。試驗(yàn)選擇2月期間，正處于寒潮期，氣溫最低達(dá) -5 ℃，最高達(dá)18 ℃，溫差大。各個(gè)小區(qū)選擇在白沙枇杷資源圃。

1.2 試材與試劑

供試試材為8年生白玉枇杷（江蘇省太湖常綠果樹技術(shù)推廣中心提供），平均株高3.0～4.0 m，冠徑4.0～4.5 m，株行距4.0～5.0 m，植株整齊度90%以上，土壤為沙質(zhì)壤土，pH值5.5～7.5。供試試劑聚天冬氨酸錳（MSOD）由河北協(xié)同環(huán)保有限公司提供，為紅棕色黏稠性液體，其固體含量大于等于30%，pH值8.5～10.5，密度為1.15 g/cm3（20 ℃）。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用噴施的方法對(duì)幼果表面進(jìn)行處理，處理藥劑為MSOD，處理方式為CK2（噴施清水）、MSOD1、MSOD2、MSOD3，濃度分別對(duì)應(yīng)0、5.0、12.5、20.0 mg/L。均勻噴施于試驗(yàn)區(qū)每株枇杷的葉面和幼果，每株樹噴施量為 3.0 L。不作任何處理的設(shè)為對(duì)照CK1，每個(gè)小區(qū)3株，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 采樣與測(cè)定 在噴施MSOD的7 d之后進(jìn)行采樣，按照每株樹樹冠的東西南北中5個(gè)方位，隨機(jī)采5穗果子。倒春寒冷空氣來(lái)臨之前，以同樣方法采1次樣，作為低溫前的對(duì)照CK1，用自封袋塑封并立即于液氮罐中貯藏，帶到實(shí)驗(yàn)室后在-70 ℃低溫冰柜中冷凍保存，每次樣品采集完成后立即測(cè)定。

相對(duì)電導(dǎo)率（relative conductivity，REC）的測(cè)定采用電導(dǎo)法，參照王學(xué)奎的《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)》[15]并略加修改。將沖洗后的果肉組織切片，稱取1 g左右，置于 50 mL 燒杯中，加20 mL去離子水，靜置1 h后，用DDS-310型電導(dǎo)儀測(cè)定電導(dǎo)值E1。測(cè)定完畢，將燒杯在電爐上封口煮沸1 min，冷卻1 h后，第2次測(cè)定電導(dǎo)值E2，然后帶入相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算公式算出最終值，用來(lái)表示枇杷幼果果肉細(xì)胞膜透性。相對(duì)電導(dǎo)率計(jì)算公式：相對(duì)電導(dǎo)率=E1/E2×100%

脯氨酸（proline，Pro）含量的測(cè)定采用磺基水楊酸法，參照王學(xué)奎的方法[15]略加修改。（1）脯氨酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制;（2）脯氨酸的提取;（3）待測(cè)液測(cè)定，用紫外分光光度計(jì)于520 nm比色，同時(shí)以甲苯為空白對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定同此操作。

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的測(cè)定，采用氮藍(lán)四唑法（NBT）;過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）活性的測(cè)定，采用愈創(chuàng)木酚法;這2種酶的測(cè)定均參照王學(xué)奎的方法[15]略加修改;丙二醛（molondialdehyde，MDA）含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法，參照湯章城的方法[16]略加修改。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 用Excel 2010整理數(shù)據(jù)，用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，采用LSD顯著差異多重比較法和Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析，檢查差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSOD對(duì)幼果細(xì)胞膜透性的影響

由表1可以看出，MSOD處理在一定程度上調(diào)節(jié)了枇杷幼果果肉組織的REC。經(jīng)協(xié)方差分析得圖1，與低溫前相比，低溫迫使CK1和CK2枇杷幼果REC增加率高達(dá)228.03%和207.35%，MSOD1、MSOD2和MSOD3處理的REC升高率相對(duì)較小，整體結(jié)果呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。其中，MSOD2的REC升高率高達(dá)116.37%，和MSOD1、MSOD3均存在顯著差異（P<0.05），表明低溫使幼果細(xì)胞膜REC增大，噴施一定濃度的MSOD可以抑制其REC的增大，從而緩解幼果組織細(xì)胞膜受損。

2.2 MSOD對(duì)幼果細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的影響

由表2可以看出，經(jīng)低溫脅迫，CK1、CK2以及MSOD各濃度處理的MDA含量變化均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。經(jīng)協(xié)方差分析得圖2，與低溫前相比，MSOD1、MSOD2、MSOD3處理的MDA含量增加率隨MSOD濃度的增加先降低后升高。MSOD3處理MDA含量增加率與其他各處理均呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05），不僅未能降低MDA含量，升高幅度反而增加了;MSOD2降低幅度最大。說(shuō)明低溫脅迫下噴施一定濃度的MSOD可以降低幼果的MDA含量，濃度過(guò)高可能對(duì)降低MDA含量不利，12.5 mg/L的噴施效果則最為明顯。

2.3 MSOD對(duì)幼果SOD活性的影響

通常脅迫條件下，SOD活性越高，植物的抗逆性就越強(qiáng)。由表3可以看出，低溫脅迫下，無(wú)論對(duì)照CK1、清水處理CK2，還是處理MSOD1、MSOD2、MSOD3，其SOD活性均有提高。經(jīng)協(xié)方差分析得圖3，與低溫前相比，CK1和CK2處理的SOD活性均有升高，MSOD各處理SOD活性升高幅度由大到小為MSOD2>MSOD1>MSOD3。這就說(shuō)明幼果在輕度低溫脅迫下抗氧化酶系統(tǒng)自身有清除活性氧的能力，可以促進(jìn)SOD活性升高;噴施MSOD可進(jìn)一步提高幼果SOD活性，從而增強(qiáng)其抵御低溫能力。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，12.5 mg/L 噴施效果最為突出。

2.4 MSOD對(duì)幼果POD活性的影響

POD在適度逆境脅迫下，通過(guò)增加酶活性以提高植物的適應(yīng)能力。由表4可以看出，低溫脅迫下CK1和CK2的POD活性均呈下降趨勢(shì)，MSOD的3種濃度處理整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。經(jīng)協(xié)方差分析得圖4，隨著MSOD處理濃度的增加，POD活性升高率先升高后下降，且MSOD2的效果最顯著（P<0.05），而MSOD3的POD活性升高率則為負(fù)值，可能是由于MSOD濃度過(guò)高抑制了POD活性的升高。初步表明，低溫脅迫對(duì)幼果的POD活性升高有抑制作用，而噴施一定濃度的MSOD可以調(diào)節(jié)或促進(jìn)幼果的POD活性升高，其中 12.5 mg/L 為最佳噴施濃度。

2.5 MSOD對(duì)幼果Pro含量的影響

由表5可以看出，各處理于低溫后Pro含量變化整體趨勢(shì)均為下降。由協(xié)方差分析得圖5，結(jié)果顯示，各處理的Pro含量變化幅度均存在顯著差異（P<0.05），其中下降幅度最大的為CK1，高達(dá)55.64%，下降幅度最小的為MSOD2，下降-13.06%，且隨MSOD濃度的增加，各處理Pro含量升高效果呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。這就說(shuō)明枇杷幼果遭受低溫脅迫的初期，細(xì)胞內(nèi)Pro含量會(huì)明顯降低，噴施MSOD可以適當(dāng)提高幼果的Pro含量，12.5 mg/L的作用效果最明顯。

3 討論與結(jié)論

近幾年來(lái)，全球氣候多變，極端天氣頻發(fā)，木本植物在自然周期生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常遭受環(huán)境低溫脅迫威脅[17]，甚至出現(xiàn)植物受凍死亡的現(xiàn)象[18-19]。低溫傷害每年都給全世界農(nóng)林生產(chǎn)造成巨大損失[20-22]。研究表明，氣象因素（溫度、光照、水分）和植物自身因素（植物的遺傳基礎(chǔ)、生長(zhǎng)時(shí)期、發(fā)育水平以及低溫脅迫下植物體內(nèi)的抗氧化水平）是影響植物抗寒性的關(guān)鍵性因素。逆境脅迫下，植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)中的SOD、POD等抗氧化酶可以清除大量活性氧，維持系統(tǒng)活性氧平衡，以保護(hù)膜組織不受傷害，從而增強(qiáng)植物體自身抵御逆境的能力[23-26]。目前，外源SOD對(duì)油菜、杏花、紫蘇、葡萄等植物抗寒性的研究[13，27-29]已有大量報(bào)道。然而，外源SOD對(duì)枇杷抗寒性的研究鮮有報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)8年生白玉枇杷幼果抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)等生理生化指標(biāo)的檢測(cè)，探討了外源SOD對(duì)枇杷幼果抗寒性的影響。

本研究結(jié)果表明，12.5 mg/L MSOD對(duì)枇杷幼果SOD和POD活性的提升有顯著效果（P<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與廖升榮等的研究結(jié)果[30-31]一致，充分證實(shí)了通過(guò)施加外源SOD達(dá)到提高果實(shí)內(nèi)源SOD活性以增強(qiáng)其抗逆性的目的，有一定的可行性。施加MSOD后，枇杷幼果的相對(duì)電導(dǎo)率隨MSOD濃度的增大先升高后降低，且12.5 mg/L作用最明顯，這與2014年王曉曉等的研究結(jié)果[32]不同。首先，這可能與試材品種、樹齡、樣本量小有關(guān);其次，也可能是由于地域問(wèn)題局部小氣候不同造成的結(jié)果。因此，外源SOD通過(guò)調(diào)節(jié)枇杷幼果REC大小以提高其抗寒性，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。MDA含量隨MSOD濃度的增加先降低后升高，這與2011年周書娟等的研究結(jié)果[33]相似，充分說(shuō)明了MDA含量可以作為表征植物抗寒性強(qiáng)弱的指標(biāo)。Pro含量變化隨MSOD濃度的增加先升高后降低，這與2009年劉玉祥等的研究結(jié)果[34]相似，證實(shí)了植物體在低溫脅迫下通過(guò)增加體內(nèi)Pro含量，來(lái)維持細(xì)胞滲透壓的穩(wěn)定水平，從而提高植物體抗寒性。因此，推測(cè)REC、MDA含量、Pro含量、SOD活性以及POD活性等指標(biāo)可能和枇杷幼果抗寒力有關(guān)。

綜上所述，低溫脅迫下，MSOD可以通過(guò)影響幼果的細(xì)胞膜透性，減少膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，增加SOD、POD等抗氧化酶的活性，提高Pro的防御反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)幼果細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)，提高其抗寒防凍能力。通過(guò)施加濃度為12.5 mg/L的MSOD，提高植物體內(nèi)抗氧化酶SOD和POD等的活性以及細(xì)胞滲透物質(zhì)Pro的含量，可能會(huì)有效提高枇杷幼果的抗寒性;通過(guò)施加濃度為12.5 mg/L的MSOD，降低植物體內(nèi)MDA含量，對(duì)枇杷幼果抗寒性的提高有一定的可行性;REC對(duì)枇杷幼果抗寒力的影響，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，須通過(guò)多地域、多品種、多齡段研究以進(jìn)一步證實(shí)。

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