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    抗藥性木霉與原始木霉菌株抑菌活性差異

    2019-08-13 08:54:10魯海菊謝欣悅張海燕
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年2期
    關(guān)鍵詞:抑制作用

    魯海菊 謝欣悅 張海燕

    摘要:以分離自黃瓜中的3株內(nèi)生木霉(Trichoderma)(J1、J3、Y2菌株)為供試菌株,用含撲海因殺菌劑的PDA培養(yǎng)基篩選到4株抗藥性菌株(PJ1-1、PJ1-2、PJ3、PY2)。測定其對枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsis microspora)P3.1、P3.5、P3.6菌株、石榴枯萎病病菌(Ceratocystis fimbriata)SK菌株和萬壽菊葉斑病病菌(Alternaria brassicicola)WJ1菌株的抑制活性。結(jié)果表明,3株抗藥性木霉(PJ1-1、PJ1-2、PJ3)對供試的5株病原菌抑菌活性均高于其原始菌株(J1和J3),且抑菌率均高于50%;抗藥性菌株P(guān)Y2對枇杷根腐病病菌P3.5菌株和石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制率均極顯著高于原始菌株(Y2),對其余3株病原菌的抑制率低于原始菌株。說明PJ1-1、PJ1-2、PJ3等3株抗藥性木霉菌株與殺菌劑撲海因混配使用的前景廣闊,此結(jié)論可以為枇杷根腐病、石榴枯萎病及萬壽菊葉斑病綠色防控提供菌種資源和理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:抗藥性木霉;撲海因;抑制作用;枇杷根腐病;石榴枯萎病;萬壽菊葉斑病

    中圖分類號: S432.4+4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A ?文章編號:1002-1302(2019)02-0083-04

    自2000年以來,云南省蒙自市石榴枯萎病[1]、枇杷根腐病[2]、萬壽菊葉斑病[3]發(fā)生普遍嚴(yán)重,亟需高效防治方法。石榴枯萎病和枇杷根腐病為土傳病害,化學(xué)防治土傳病害存在施藥困難、成本高、容易引起殘留及環(huán)境污染等問題。枇杷及石榴抗病育種工作目前相對滯后,在枇杷和石榴中尋找抗枇杷根腐病及石榴枯萎病的基因,成功培育出抗性品種,在短期內(nèi)難以實現(xiàn)。目前看來,生物防治是一種經(jīng)濟(jì)有效的控制土傳病害的方法。

    木霉菌(Trichoderma)是當(dāng)前最有效且有巨大開發(fā)價值及潛力的生防菌。對多種植物病原菌表現(xiàn)拮抗活性[4],并可用來防治部分土傳植物病害[5]。但是木霉生防制劑受田間不穩(wěn)定因素的影響較大、缺乏抗藥能力等缺陷,限制了其在生產(chǎn)中的應(yīng)用[6]。木霉成功定殖于植物根際土壤及其植株中,是木霉菌劑發(fā)揮生防作用的前提條件。而農(nóng)藥殘留是木霉成功定殖的限制因素之一。因此,篩選抗藥性木霉菌株尤為重要。筆者從3株黃瓜內(nèi)生木霉中,篩選獲得4株抗撲海因化學(xué)殺菌劑的木霉。為弄清抗藥性木霉的抑菌活性是否衰退,擬測定其對石榴枯萎病病菌、枇杷根腐病病菌和萬壽菊葉斑病病菌的抑菌活性,以期為云南省蒙自市3種重要植物病害的綠色防控提供生防菌種資源。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 供試菌株 J1、J3、Y2均為內(nèi)生木霉菌株,分離自黃瓜的莖(J1和J3菌株)和葉(Y2菌株)。枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsis microspora)(P3.1、P3.5、P3.6菌株)、石榴枯萎病病菌(Ceratocystis fimbriata)(SK菌株)、萬壽菊葉斑病病菌(Alternaria brassicicola)(WJ1菌株)分別分離自枇杷根腐病病株根莖韌皮部、石榴枯萎病病株枝干木質(zhì)部、萬壽菊葉斑病病葉。置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,簡稱PDA)培養(yǎng)基中低溫(4 ℃)保存,保存于云南省紅河學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物病理教學(xué)實驗室。

    1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200.0 g、葡萄糖18.0 g、瓊脂13.5 g、蒸餾水1 000.0 mL;PDA含藥培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖18 g、撲海因100 mg、蒸餾水1 000 mL。上述培養(yǎng)基配好后均在121 ℃高壓滅菌30 min。馬鈴薯購自農(nóng)貿(mào)市場,葡萄糖、瓊脂、撲海因均購自云南科儀化玻有限公司,試劑均為分析純。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 抗藥性菌株篩選 PDA培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至 45 ℃,加入100 mg/L撲海因后倒平板。將各供試木霉菌株在PDA培養(yǎng)基平板中,28 ℃恒溫擴(kuò)大培養(yǎng)5 d,在培養(yǎng)基同一半徑周圍,用打孔器取直徑為5 mm的菌餅,接種至PDA含藥平板中央。設(shè)3次重復(fù),在28 ℃下恒溫培養(yǎng),接種不加藥的PDA培養(yǎng)基為對照。第7天觀察是否長菌落。

    1.2.2 對峙培養(yǎng) 供試菌株擴(kuò)大培養(yǎng)及打取菌餅方法同“1.2.1”節(jié)中的方法,采用對峙培養(yǎng)法[7],將木霉與病菌兩兩組合,同時接種于無菌PDA平板(直徑90 mm)中,2個接種點(diǎn)相距 45 mm,以不接種木霉菌株的PDA培養(yǎng)基作對照,設(shè)3次重復(fù),在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng),第7天測定病菌的菌落直徑,計算其生長抑制率。

    抑制率=[(dCK-dB)/dCK]×100%。

    式中:dCK表示對照病菌菌落直徑;dB表示處理病菌菌落直徑。

    1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncans多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計分析,計算處理間的差異顯著性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 原始木霉與抗藥性木霉菌株菌落特征

    木霉菌J1、J3、Y2菌株經(jīng)含撲海因殺菌劑PDA平板培養(yǎng),獲得4株抗藥性木霉菌菌株,分別為PJ1-1、PJ1-2(J1的抗藥性菌株)、PJ3(J3的抗藥性菌株)、PY2(Y2的抗藥性菌株),抗藥性菌株比原始菌株的菌落顏色淺(圖1)。

    2.2 各供試木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制作用

    由表1可知,7個木霉菌株對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制率差異極顯著(P<0.01)。抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制率均高于57%,抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株。抗藥性菌株P(guān)Y2對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑制率略低于其原始菌株。說明抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.1菌株的抑菌活性未衰退。其中,PJ1-1和PJ1-2抗藥性菌株完全覆蓋枇杷根腐病病菌P3.1菌株,其上長出大量分生孢子,重寄生作用明顯強(qiáng)于原始菌株(圖2)。

    2.3 各供試木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制作用

    由表2可知,7個木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制率差異極顯著(P<0.01)??顾幮跃關(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制率均高于50%,抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株??顾幮跃關(guān)Y2對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑制率極顯著高于其原始菌株(P<0.01)。說明抗藥性菌株 PJ1-1、PJ1-2、PJ3、PY2對枇杷根腐病病菌P3.5菌株的抑菌活性未衰退。其中,PJ1-1抗藥性菌株的菌落完全覆蓋枇杷根腐病病菌P3.5菌株,其上長出大量分生孢子,重寄生作用明顯強(qiáng)于原始菌株(圖3)。

    2.4 各供試木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制作用

    由表3可知,7個木霉菌菌株對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制率差異極顯著(P<0.01)??顾幮跃關(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制率均高于60%,抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株??顾幮跃關(guān)Y2對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制率低于其原始菌株,但產(chǎn)孢能力增強(qiáng)(圖4)。說明抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對枇杷根腐病病菌P3.6菌株的抑制活性未衰退。其中,抗藥性菌株P(guān)J1-1完全覆蓋枇杷根腐病病菌P3.6菌株,其上長出大量分生孢子,重寄生作用明顯強(qiáng)于其原始菌株(圖4)。

    2.5 各供試木霉菌菌株對石榴枯萎病病菌的抑菌作用

    由表4可知,7個木霉菌菌株對石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制率差異極顯著(P<0.01)??顾幮跃關(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3的抑制率均高于71%,抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株。抗藥性菌株P(guān)Y2菌株對石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制率極顯著高于其原始菌株(P<0.01)。說明抗藥性菌株 PJ1-1、PJ1-2、PJ3、PY2對石榴枯萎病病菌SK菌株的抑制活性未衰退。其中,抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3的產(chǎn)孢能力有所下降(圖5)。

    2.6 各供試木霉菌菌株對萬壽菊葉斑病病菌的抑菌作用

    由表5可知,7個木霉菌菌株對萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株均具有不同程度的抑制作用??顾幮跃關(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株的抑制率均高于62%,抑菌作用強(qiáng)于其原始菌株。抗藥性菌株P(guān)Y2對萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株的抑制率極顯著低于其原始菌株。說明抗藥性菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株的抑制活性未衰退。其中,PJ1-1和PJ1-2抗藥性菌株完全覆蓋萬壽菊葉斑病病菌WJ1菌株,其上長出大量分生孢子,重寄生作用明顯強(qiáng)于其原始菌株(圖6)。

    3 結(jié)論與討論

    抗藥性木霉菌株P(guān)J1-1、PJ1-2、PJ3對供試的5株病原菌抑菌活性均高于原始菌株J1和J3,其中,PJ1-1菌株完全覆蓋病原菌,其上產(chǎn)生大量分生孢子。說明其具有極強(qiáng)的重寄生能力,生防前景廣闊。前人曾研究獲得抗腐霉利[8]、抗苯菌靈[7]、多菌靈[9-10]、速克靈[11-12]、能降解敵敵畏[13]、毒死蜱和甲胺磷[14]等的抗藥性木霉菌菌株。但篩選獲得抗撲海因的木霉菌菌株尚屬首次。

    我國化肥和農(nóng)藥過量施用現(xiàn)象較嚴(yán)重,由此引起環(huán)境污染和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全等重大問題。農(nóng)作物綠色防控的呼聲越來越高。木霉與化學(xué)農(nóng)藥混配使用能大大降低化學(xué)農(nóng)藥施用量,有時還能發(fā)揮協(xié)同增效作用。例如,段銀芝等研究發(fā)現(xiàn),吡蟲啉、咪唑乙煙酸、咪唑煙酸等3種農(nóng)藥能促進(jìn)哈茨木霉菌菌絲生長及產(chǎn)孢[15]。田連生等報道,木霉菌劑與多菌靈混配防治灰霉病有協(xié)同增效作用[16]。任鳳山等發(fā)現(xiàn),木霉與幾種殺菌劑混配能增強(qiáng)對蘋果輪紋病的防治效果[17]。木霉菌 PJ1-1 菌株與撲海因混配施用, 防治石榴枯萎病、枇杷根腐病和萬壽菊葉斑病是否具有協(xié)同增效作用,有待進(jìn)一步研究。

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