4個(gè)早熟梨品種葉片對黑斑病的抗病性評價(jià)及與抗氧化酶的關(guān)系

王宏 馬娜 藺經(jīng)

摘要：對翠冠、蘇翠1號、華酥和七月酥等4個(gè)梨品種，接種黑斑病菌，評價(jià)不同品種的發(fā)病率、發(fā)病程度、病斑生長速度。通過分析比較葉片中超氧陰離子自由基（ O-2 · ?）、超氧化物歧化酶 （SOD） 、過氧化氫（H2O2）、過氧化氫酶 （CAT）的活性變化，探討不同梨品種的抗病機(jī)制。結(jié)果表明，4個(gè)品種中，翠冠和蘇翠1號較抗病，華酥、七月酥較感病。接種病原菌引起翠冠和蘇翠1號梨葉片 O-2 · ?和H2O2活性升高，同時(shí)抗氧化酶SOD和CAT活性也上升;華酥葉片 O-2 · ?和SOD活性升高，但是CAT含量降低;而七月酥無論是活性氧或解毒酶含量均下降。表明活性氧信號參與了翠冠、蘇翠1號和華酥對黑斑病的響應(yīng)，而CAT作為解毒酶，參與了翠冠和蘇翠1號對黑斑病的抗性響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：梨;黑斑病;抗病性;活性氧;抗氧化酶

中圖分類號： S436.612.1+4 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0080-03

梨黑斑病是梨主要病害之一，由絲孢綱絲孢目鏈格孢屬真菌[Alternaria alternata （Fr） Keissler]引起[1-2]。病原菌侵染葉片、果實(shí)、新稍，在病葉、病梢及病果上越冬[1]。來年春天，病部產(chǎn)生分生孢子，借風(fēng)雨傳播，進(jìn)行初次侵染[1]。雨季，病原菌孢子迅速擴(kuò)散，在1～2周內(nèi)，60%～80%的葉片即可發(fā)病[1]，對梨產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，制約了梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

國內(nèi)外對該病的防治有大量研究，目前防治該病的主要方法仍然是化學(xué)防治[2]。化學(xué)藥劑的使用存在潛在的危害，會造成污染環(huán)境，影響人體健康，長期使用還會引起病原菌對化學(xué)藥劑的抗藥性等。提高梨樹抗病能力是擴(kuò)大梨果產(chǎn)量和改善梨果品質(zhì)的關(guān)鍵。梨黑斑病菌是一種死體營養(yǎng)型病原真菌[3]。在長期的植物病原菌互作中，植物自身形成了多種防御機(jī)制，抵御了黑斑病菌的侵染[3]。研究砂梨不同品種對黑斑病的防御機(jī)制，為梨黑斑病的合理防治及砂梨抗黑斑病的分子育種奠定理論基礎(chǔ)。

本研究室選育的蘇翠1號以早熟梨華酥為母本，翠冠為父本雜交選育而成，該品種果實(shí)成熟早、品質(zhì)優(yōu)、外觀好 [4]，目前在生產(chǎn)中進(jìn)行推廣和應(yīng)用。其對黑斑病的抗病性和抗病機(jī)理未有系統(tǒng)報(bào)道。本試驗(yàn)對包括翠冠、蘇翠1號、華酥在內(nèi)的4個(gè)梨品種接種黑斑病病原菌，調(diào)查了葉片發(fā)病情況及感病期間活性氧[超氧陰離子自由基（ O-2 · ?）和過氧化氫（H2O2）]及活性氧清除酶[超氧化物歧化酶（SOD） 和過氧化氫酶（CAT）]的活性，為實(shí)際生產(chǎn)中梨黑斑病的合理防治和砂梨抗黑斑病育種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹所梨研究室實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 供試?yán)嫫贩N 翠冠、蘇翠1號、華酥、七月酥，均來源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院梨種質(zhì)資源圃。

1.2.2 供試菌株 黑斑病病原菌[Alternaria alternata （Fr） Keissler]，來源于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所劉鳳權(quán)老師研究室[5]。

1.3 接種方法

黑斑病病原菌接種在土豆瓊脂培養(yǎng)基上，16 h（25 ℃）/8 h（22 ℃）光周期培養(yǎng)4 周后，收集病原菌孢子，將孢子懸浮液濃度稀釋為1.0×106 個(gè)孢子/mL用于接種葉片[3]。取生長4周的植株頂部往下第4 張葉片，將葉片正面向上放入0.6%的瓊脂培養(yǎng)基上，無菌針刺穿葉片表面，接種病原菌[3]。處理和對照各80張葉片，并平均分作2組，一組用于接種病原菌，每張葉片接種2滴 10 μL 孢子懸浮液，另一組只接種無菌水。葉片接種后置于25 ℃暗培養(yǎng)，每天觀察葉片發(fā)病情況，以發(fā)病率（發(fā)病葉片占總接種葉片的比例）和病斑直徑作為衡量發(fā)病程度的指標(biāo)[3]。

1.4 檢測項(xiàng)目及方法

活性氧自由基、SOD、H2O2及CAT的活性測定均采用江蘇南京建成生物工程研究所響應(yīng)的試劑盒，試劑盒編號分別為A052、A001-1-1、A064、A007-1-1[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 4個(gè)梨品種葉片黑斑病發(fā)病差異

葉片在接種后2 d形成病斑，4個(gè)品種中，翠冠和蘇翠1號發(fā)病程度較輕，其次是華酥，發(fā)病最重的為七月酥（圖1-A）。接種病原菌后2 d，翠冠的發(fā)病率為25%，華酥為80%，七月酥為83.3%。隨著接種時(shí)間延長，翠冠葉片上的發(fā)病率逐漸上升，到接種后7 d為75%。接種后3～5 d，蘇翠1號發(fā)病率為75%;接種接種后6 d達(dá)到了100%。接種后 3 d，華酥的發(fā)病率達(dá)到了100%。七月酥在接種后接種后 3～5 d的發(fā)病率仍為83.3%，接種后6 d達(dá)到了100%（圖1-B）。4個(gè)品種上病斑每日平均生長速率不同。日平均生長速率分別為翠冠 1.43 mm/d，蘇翠1號1.50 mm/d，華酥 1.79 mm/d，七月酥2.19 mm/d。

2.2 超氧陰離子自由基活性的變化

接種病原菌后，翠冠、蘇翠1號、華酥和七月酥的 O-2 · ?活性都受到不同程度的影響（圖2）。在接種后3 d，前3個(gè)品種的 O-2 · ?活性都高于未接種時(shí)，接種后5 d， O-2 · ?活性下降。接種后，七月酥的 O-2 · ?活性下降。

2.3 SOD活性的變化

接種病原菌后，翠冠、蘇翠1號、華酥和七月酥的SOD活性都受到不同程度的影響（圖3）。在接種后3 d，前3個(gè)品種的SOD活性都高于未接種時(shí)，接種后5 d，SOD活性下降。接種后，七月酥的SOD活性下降。

2.4 H2O2活性的變化

與接種前比較，接種病原菌后 3 d，翠冠和蘇翠1號的H2O2活性上升，而華酥和七月酥的H2O2活性下降（圖4）。在接種后5 d，4個(gè)品種的H2O2活性均下降。

2.5 CAT活性的變化

與接種前比較，接種病原菌后，翠冠和蘇翠1號的CAT活性上升，而華酥和七月酥的CAT活性下降（圖5）。

3 討論與結(jié)論

梨黑斑病是梨樹主要病害之一，在我國各梨產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，尤其在南方夏季多雨時(shí)，梨園樹體發(fā)病嚴(yán)重[1]，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，并在梨進(jìn)出口貿(mào)易中受到進(jìn)口國的嚴(yán)密關(guān)注[1]。防治梨黑斑病的關(guān)鍵是抗病育種，鑒定梨種質(zhì)資源對黑斑病的抗性是培育新品種的關(guān)鍵。蘇翠1號為本研究室培育的新品種，因其成熟早，品質(zhì)憂，外觀好[4]，在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用后受到廣泛好評。但是其對黑斑病的抗性未有系統(tǒng)報(bào)道。本試驗(yàn)用其母本華酥、父本翠冠以及七月酥作為對照品種，調(diào)查了離體條件下，4個(gè)品種梨葉片對黑斑病的抗性，并分析了抗病機(jī)制。結(jié)果表明4個(gè)早熟品種中，翠冠和蘇翠1號較抗病，其次是華酥，七月酥最感病。

在植物與死體營養(yǎng)型病原菌互作中，病原菌一般通過分泌多種毒力因子，調(diào)節(jié)宿主響應(yīng)（如植物激素、活性氧（ROS）等激活細(xì)胞壞死）來實(shí)現(xiàn)定植蔓延[6]。ROS作為一種信號分子誘導(dǎo)抗性反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞壞死，并且具有抗菌活性[7]。ROS以 O-2 · ?和H2O2的形式存在。SOD催化 O-2 · ?形成H2O2[8] ，胞外形成的H2O2進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞程序性死亡[9]。死體營養(yǎng)型病原菌從壞死的組織吸取營養(yǎng)，從而大量擴(kuò)展[9]。CAT作為解毒酶，把H2O2分解為H2O和O2[8]。研究表明，CAT突變體表現(xiàn)出了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡癥狀[10]。很多研究也證實(shí)，對于死體營養(yǎng)型病原菌，植物產(chǎn)生的ROS毒性的大小直接取決于植物產(chǎn)生的超氧化物和過氧化氫的濃度[9]。本試驗(yàn)比較了接種黑斑病病原菌后，4個(gè)品種的活性氧和抗氧化酶的活性。接種早期，翠冠和蘇翠1號的 O-2 · ?、SOD、H2O2和CAT的活性較高，而華酥和七月酥上 O-2 · ?、SOD、H2O2和CAT的活性下降。表明病原菌觸發(fā)了翠冠和蘇翠1號產(chǎn)生ROS，而較高的CAT含量表明CAT參與H2O2的解毒，抑制了H2O2引起的細(xì)胞死亡，從而提高了這2個(gè)品種的抗病性。

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