利用廢紙產(chǎn)纖維素酶復(fù)合菌系的篩選及性質(zhì)研究

曹燕篆 王小娟 袁旭峰

摘要：為了獲得1組能夠高效分解廢紙并產(chǎn)胞外纖維素酶的復(fù)合菌系，采用外淘汰法，在常溫條件下以土壤及枯枝落葉為菌源，以廢打印紙為唯一碳源，篩選得到1組復(fù)合菌系PSD。結(jié)果表明，該復(fù)合菌系能夠在6 d內(nèi)分解紙總質(zhì)量的71%，其中纖維素降解率為72%，半纖維素降解率為48%。此外，羧甲基纖維素酶活性在分解3 d時達(dá)到最高值 3.26 U/mL，半纖維素酶活性在分解4 d時達(dá)到最高值6.37 U/mL。當(dāng)培養(yǎng)溫度在25～35 ℃，培養(yǎng)基pH值在 6.0～8.0，培養(yǎng)基為Hutchinson時，復(fù)合菌系具有較好的紙分解效果和產(chǎn)酶活性。利用16S及26S rRNA克隆技術(shù)分析微生物組成結(jié)果表明，該復(fù)合菌系由細(xì)菌和真菌組成，其中細(xì)菌主要包括厚壁菌門、變形菌門及擬桿菌門，真菌主要包括波氏假性霉樣菌（Pseudallescheria boydii）。由研究結(jié)果可知，得到的復(fù)合菌系PSD能夠有效分解廢紙并同時分泌纖維素酶，對打印紙廢棄物的分解及資源利用具有一定的應(yīng)用意義。

關(guān)鍵詞：復(fù)合菌系;廢紙分解;纖維素酶;微生物組成

中圖分類號： S182;X705 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2019）01-0237-05

隨著現(xiàn)代制造技術(shù)的發(fā)展，一次性紙張已經(jīng)成為廉價商品，過去40年內(nèi)，全球紙的消費量增長了400%，每年產(chǎn)生的廢紙量達(dá)4億t以上。廢紙作為最普遍的回收材料之一，理論上可循環(huán)使用6～7次，但是紙經(jīng)多次回用后纖維流失率大，且纖維短，利用效率低，因此，全球紙張的平均回收水平只有2.4次[1]。不合理處理無法循環(huán)利用的廢紙（如填埋或焚燒），會造成溫室氣體的排放、垃圾滲濾液污染等環(huán)境問題[2]。因此，開發(fā)多種資源化利用方式，對廢紙進(jìn)行充分利用，不僅可以節(jié)約大量植物木質(zhì)纖維原料，同時可以減少固體廢棄物的排放及對環(huán)境的污染。

廢紙主要由纖維素（40%～80%）、半纖維素（5%～15%）及少量的木質(zhì)素組成[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，利用多種技術(shù)可將廢紙轉(zhuǎn)化為乙醇、甲烷、氫等能源物質(zhì)[4-6]，為了提高轉(zhuǎn)化率，往往需要物理、化學(xué)或酶預(yù)處理，從而在一定程度上增加了經(jīng)濟成本，或?qū)Νh(huán)境造成了一定的污染。其中利用酶轉(zhuǎn)化廢紙材料具有很多優(yōu)勢，如底物特異性高、能源消費低、環(huán)境污染水平低等。然而，昂貴的成本成為纖維素酶制劑應(yīng)用的瓶頸。近年來，利用農(nóng)業(yè)或者工業(yè)廢棄物通過液體或固體發(fā)酵的方式生產(chǎn)纖維素酶成為研究熱點，例如以水稻秸稈、玉米穗、象草、甘蔗渣及生活污水等為底物[7-12]。在纖維素酶的相關(guān)研究中，由于真菌能夠分泌大量纖維素酶及半纖維素酶，并且會將其分泌到細(xì)胞外至培養(yǎng)基中，易于分離純化，成為重要的研究對象。但是，用真菌單獨分解木質(zhì)纖維素材料往往需要較長時間[13]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合菌系能夠有效降解水稻秸稈、玉米秸稈、柳枝稷及濾紙等木質(zhì)纖維素材料，但是以液體微好氧條件培養(yǎng)的復(fù)合菌系胞外酶活性較低[14-15]。因此，在好氧條件下篩選1組由真菌及細(xì)菌共同組成，且能夠高效分解廢紙并分泌纖維素酶的復(fù)合菌系，對廢紙的資源化利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 復(fù)合菌系的篩選

復(fù)合菌系篩選用Mandels固體培養(yǎng)基，配方如下：1.4 g（NH4）2SO4，2.5 g蛋白胨，0.3 g MgSO4·7H2O，2 g CaCO3，2 g KH2PO4，5 mg FeSO4·7H2O，1.6 mg MnSO4，1.7 mg ZnCl2，1.7 mg CoCl2，12 g瓊脂，1 L去離子水，調(diào)節(jié)pH值至7.0。將培養(yǎng)基于121 ℃滅菌30 min后倒平板待用。

菌源于2010年取自北京植物園的土壤、枯枝落葉，加入50 mL滅菌去離子水，于200 r/min振蕩20 min，吸取1 mL至上述培養(yǎng)基平板上，將（0.5±0.1） g滅菌的廢打印紙蓋在培養(yǎng)基表面作為唯一碳源，于30 ℃靜置培養(yǎng)。待廢紙分解后，將殘余部分刮下并置于50 mL滅菌離心管中，加入30 mL滅菌去離子水，混勻后吸取0.5 mL進(jìn)行轉(zhuǎn)接。淘汰廢紙分解效率低的菌系，將分解能力強的復(fù)合菌系每隔4～6 d轉(zhuǎn)接1次，直至功能穩(wěn)定。向培養(yǎng)3 d的復(fù)合菌系與分解剩余的紙中加入25%甘油，于-80 ℃保存。

1.2 降解率

通過測定紙的總質(zhì)量減少量及木質(zhì)纖維素成分質(zhì)量減少量，分析復(fù)合菌系對廢紙的分解能力。將培養(yǎng)3 d的復(fù)合菌系通過“1.1”節(jié)的方法制備菌液并接種到21個新的培養(yǎng)基上，加入滅菌的廢紙培養(yǎng)6 d，從0 d開始每天取樣，每次3個重復(fù)，于60 ℃烘干48 h后稱質(zhì)量分析紙的分解情況。將殘余的紙烘干后剪至5 mm×5 mm大小，裝入F57專用袋（Model F57，ANKOM Technology，USA）中，根據(jù)ANKOM220型纖維分析儀說明書測定纖維素、半纖維素含量。

1.3 粗酶液的制備及酶活性的測定

在培養(yǎng)期間，收集分解殘余的紙制備粗酶液。從平板上刮下分解剩余的紙，加入30 mL滅菌去離子水充分混勻，浸提底物表面的胞外酶，于8 000 r/min離心10 min后所得上清液即為制備好的粗酶液。羧甲基纖維素酶活性及木聚糖酶活性的測定方法參照文獻(xiàn)[16]。

1.4 最佳產(chǎn)酶條件

纖維素酶的產(chǎn)生會受培養(yǎng)基pH值、發(fā)酵溫度及養(yǎng)分等的影響[17]，為了確定復(fù)合菌系分解廢紙過程中的最佳產(chǎn)酶條件，設(shè)置不同培養(yǎng)溫度（25～45 ℃）、培養(yǎng)基pH值（5.0～8.0）及培養(yǎng)基種類（Mandels、Hutchinson、Dubos、PCS及PA）。不同培養(yǎng)基養(yǎng)分組成如下。（1）Hutchinson：1 g/L KH2PO4，0.3 g/L MgSO4·7H2O，0.01 g/L FeCl3，0.1 g/L CaCl2·6H2O，0.1 g/L NaCl，2.5 g/L NaNO3。（2）Dubos：1 g/L K2HPO4，1 g/L NaNO3，0.5 g/L MgSO4·7H2O，0.5 g/L KCl，0.05 g/L Fe2（SO4）·H2O。（3）PCS：5 g/L蛋白胨，1 g/L酵母粉，2 g/L CaCO3，5 g/L NaCl。（4）PA培養(yǎng)基：在1 L去離子水中加入200 g馬鈴薯條，煮沸5 min，用紗布過濾后加入去離子水將總體積補足至1 L。上述培養(yǎng)基中均加入12 g/L瓊脂，調(diào)節(jié)pH值至7.0，于121 ℃滅菌30 min。在上述不同條件下，復(fù)合菌系于接種后4 d取樣，測定廢紙的減質(zhì)量及粗酶液酶活性。

1.5 復(fù)合菌系微生物組成分析

復(fù)合菌系基因組DNA的提取采用苯酚-三氯甲烷抽提法，將提取后的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴增。DGGE（變性梯度凝膠電泳）及克隆方法參照文獻(xiàn)[15]。測序結(jié)果使用Lasergene軟件（DNAStar，Madison，Wisconsin，USA）進(jìn)行分析，序列相似性比對通過BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/），用MEGA 5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌系PSD對廢打印紙的分解能力

經(jīng)過連續(xù)傳代30次以上，篩選到1組能夠有效分解廢紙并產(chǎn)纖維素酶的復(fù)合菌系PSD。由圖1接種復(fù)合菌系后廢紙的總質(zhì)量降幅及木質(zhì)纖維素質(zhì)量降幅可以看出，培養(yǎng)3 d后，紙的總質(zhì)量減少了24.9%，其中纖維素、半纖維素分別減少了38.1%、29.9%。分解6 d后，復(fù)合菌系PSD對廢紙的分解率達(dá)到70.6%，其中纖維素減少了71.7%，半纖維素減少了48.2%。從圖1還可以看出，培養(yǎng)3～6 d期間廢紙的分解速率高于培養(yǎng)0～3 d的，并且復(fù)合菌系對廢紙中纖維素成分的分解率高于半纖維素。

2.2 酶活性的變化

從圖2可以看出，羧甲基纖維素酶、木聚糖酶活性在接種復(fù)合菌系2 d后快速增加，羧甲基纖維素酶活性在接種復(fù)合菌系3 d后達(dá)到最高值，為3.26 U/mL，木聚糖酶活在接種復(fù)合菌系4 d后達(dá)到最高值，為6.37 U/mL。結(jié)合圖1中復(fù)合菌系對廢紙降解率的影響，可見分解2 d后酶活性的快速提高增強了復(fù)合菌系對廢紙的分解能力，此外復(fù)合菌系PSD能夠有效分解廢紙并以廢紙為底物分泌活性較高的纖維素酶。崔宗均等以堆肥為菌源，篩選到1組能夠高效分解天然木質(zhì)纖維素的復(fù)合菌系MC1，但是其胞外酶活性很低[18]。另外，復(fù)合菌系XDC-2雖然能夠分泌高活性的胞外木聚糖酶，但胞外羧甲基纖維素酶活性卻很低，只有0.108 U/mL[19]。Richa等從土壤中分離出一些能夠有效分解紙的真菌，但有關(guān)紙的分解情況及產(chǎn)酶情況并沒有相關(guān)報道[20]。

2.3 產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

在不同培養(yǎng)條件下，接種復(fù)合菌系PSD 4 d后紙的分解率及產(chǎn)酶活性見圖3?？梢钥闯?，當(dāng)培養(yǎng)溫度為25～35 ℃時，廢紙的分解率及粗酶液的酶活性都較高，其中30 ℃時的分解率最高，為36.1%，在25 ℃條件下，復(fù)合菌系產(chǎn)酶的酶活性最高。但是當(dāng)溫度≥40 ℃時，廢紙的分解率及酶活性明顯下降。由此可見，復(fù)合菌系在溫度≤35 ℃時能有效降解廢紙并產(chǎn)纖維素酶（圖3-A）。當(dāng)培養(yǎng)基pH值為6.0時，羧甲基纖維素酶活性、半纖維素酶活性都達(dá)到最高值。將其最高相對酶活性視為100%，當(dāng)培養(yǎng)基pH值高于6.0時，羧甲基纖維素酶、半纖維素酶的相對酶活性分別高于73%、86%，廢紙的總分解率大于45%，并且當(dāng)培養(yǎng)基pH值為7.0時，分解率最高，為51.1%。但是當(dāng)pH值小于6.0時，無論是廢紙的降解率，還是復(fù)合菌系產(chǎn)纖維素酶的酶活性都明顯降低?？傮w看出，pH值為6～8時，復(fù)合菌系有較好的紙分解效果和產(chǎn)酶活性（圖3-B）。以Hutchinson為培養(yǎng)基廢紙為唯一碳源時，復(fù)合菌系對廢紙的降解率最高，為50.1%，并且羧甲基纖維素的酶活性最高。當(dāng)培養(yǎng)基為Hutchinson、Mandels及Dubos時，廢紙的降解率及酶活性明顯高于PCS、PA培養(yǎng)基的降解率與酶活性（圖3-C）。由此可見，Hutchinson為復(fù)合菌系分解及產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)基。

2.4 復(fù)合菌系PSD的微生物組成穩(wěn)定性

為了確定復(fù)合菌系PSD的微生物組成已經(jīng)穩(wěn)定，利用PCR-DGGE技術(shù)對其總DNA進(jìn)行分析。保存復(fù)合菌系繼代培養(yǎng)過程中4 d后的培養(yǎng)物（第30、33、36、39代），提取總DNA并利用引物對357F-GC、517R及NL1-GC、LS2分別進(jìn)行PCR擴增后用于DGGE分析。細(xì)菌、真菌的DGGE圖譜見圖4，可見繼代培養(yǎng)過程中不同代真菌、細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)相同，說明經(jīng)過長期馴化培養(yǎng)，復(fù)合菌系PSD的菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，復(fù)合菌系在分解木質(zhì)纖維素過程中群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性能夠保證其功能的穩(wěn)定性。

2.5 復(fù)合菌系PSD的微生物組成

利用克隆技術(shù)，分析復(fù)合菌系PSD的微生物組成，其16S rDNA、26S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分別見圖5、圖6。本研究共獲得200個細(xì)菌克隆子，測序分析結(jié)果表明，主要為厚壁菌門（31.1%）、變形菌門（24.1%）及擬桿菌門（44.6%），其中厚壁菌門主要包括Sedimentibacter、柯恩氏菌（Cohnella）及泰氏菌屬（Tissierella）?？寺∽覤74與Sedimentibacter sp. enrichment culture clone MB2_218有96%的相似性，有報道稱，該菌對1，2，4-三氯二苯并-對-二英具有還原脫氯的作用[21]?？寺∽覤102、B160與Cohnella sp. FCN3-3（HQ704069）具有98%的相似性，該菌是1株從牛糞中分離并具有纖維素分解能力的細(xì)菌[22]。變形菌門主要包括假單胞菌（Pseudomonas）、不粘柄菌屬（Asticcacaulis）及紅桿菌屬（Rhodobacter），其中克隆子B35與Pseudomonas stutzeris（施氏假單胞菌） train S1（AY485995）具有99%的相似性，該菌是從土壤中分離得到的，具有降解氟氯氰菊酯的能力[23]。擬桿菌門主要包括哈氏噬纖維菌（Cytophaga hutchinsonii）、Cf. Cytophaga、Dysgonomonas及Chitinophaga。其中克隆子B31與Cytophaga hutchinsonii ATCC 33406（CP000383）具有91%的相似性，對該菌的基因組測序發(fā)現(xiàn)能夠編碼很多參與纖維素利用的基因[24]。另外，在復(fù)合菌系XDC-2的微生物組成中也檢測到Pseudomonas stutzeri、Dysgonomonas的存在[19]。Wang等篩選到的1組能夠高效降解木質(zhì)素、芳香族化合物的復(fù)合菌系LDC中有Pseudomonas sp.、Cohnella的存在[25]。

對獲得的180個真菌克隆子進(jìn)行測序的結(jié)果表明，共有波氏假性霉樣菌（Pseudallescheria boydii）、Filobasidium floriformes及輪枝菌（Verticillium sp.）3種真菌，其中80.7%的序列與Pseudallescheria boydii（AB363764）具有99%的相似性。據(jù)報道，該菌廣泛存在于堆肥中，可有效降解有機物，同時還可利用碳?xì)浠衔锛皳]發(fā)性烷烴類物質(zhì)，如乙烷、丙烷、丁烷等[26-27]。另外，研究發(fā)現(xiàn)Pseudallescheria boydii可有效降解有毒物質(zhì)2，3，7，8-四氯二苯并二英及多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，簡稱PAHs）[28-29]。12.5%的序列與Verticillium sp.（AY312607）具有99%的相似性，有研究發(fā)現(xiàn)，黑白輪枝菌（Verticillium alboatrum）、黃萎病病菌（Verticillium dahliae）都能夠分泌多種纖維素酶并能有效分解纖維素。Klosterman等對這2株真菌進(jìn)行宏基因組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因組中有很多編碼果膠降解酶及碳水化合物活性酶的基因[30-31]。據(jù)筆者所知，本研究是第1次在復(fù)合菌系中檢測到有Verticillium sp.的組成。因此可見，PSD是一組由細(xì)菌和真菌共同組成的復(fù)合菌系。

3 結(jié)論

本研究成功篩選到1組能夠高效降解廢紙，同時分泌胞外纖維素酶的復(fù)合菌系PSD。該復(fù)合菌系能夠在6 d內(nèi)分解紙總質(zhì)量的71%，其中纖維素、半纖維素的降解率分別為72%、48%。在復(fù)合菌系分解廢紙期間，胞外羧甲基纖維素酶活性在3 d時達(dá)到最高值，為3.26 U/mL，半纖維素酶活性在 4 d 時達(dá)到最高值，為6.37 U/mL。

16S rDNA、26S rDNA克隆文庫結(jié)果表明，復(fù)合菌系由真菌、細(xì)菌組成，其中細(xì)菌Cohnella、Pseudomonas及Cytophaga hutchinsonii可能是功能菌，Pseudallescheria boydii是主要的真菌組成。

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