迎春櫻組培快繁體系研究

南程慧 薛曉明 伊賢貴

摘要：以MS+0.1 mg/L NAA為基本培養(yǎng)基，迎春櫻無菌初代培養(yǎng)材料于2～4 mg/L 6-BA誘導(dǎo)10 d后轉(zhuǎn)接于MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)為5.9～10.7;壯苗培養(yǎng)以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3+5 g/L瓊脂為宜，材料后期生長(zhǎng)旺盛，培養(yǎng)基污染率低，材料于C1中誘導(dǎo)10 d后轉(zhuǎn)接于此培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為8.2，叢芽健壯;以3/4MS為基本培養(yǎng)基，NAA濃度為0.04～0.08 mg/L時(shí)，生根率為 91.5%～100.0%，不定根較多，莖葉健壯;生根苗開瓶后直接移栽于V細(xì)沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1組成的基質(zhì)穴盤中，培養(yǎng)室中生長(zhǎng)20 d時(shí)成活率為93.8%。

關(guān)鍵詞：迎春櫻;組培;培養(yǎng)基;增殖系數(shù);生根率;快繁體系

中圖分類號(hào)： S685.120.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0048-04

迎春櫻（Cerasus discoidea）屬薔薇科（Rosaceae）櫻屬（Cerasus）[1-2]，是我國(guó)野生櫻花資源中的特有種;傘形花序，著花1～3朵，花色粉紅，2—3月先葉開放，為早春優(yōu)質(zhì)的觀賞花木;主要分布于安徽南部、江西東北部、浙江大部等地的山谷林中或溪邊灌叢中海拔200～1 100 m處。

迎春櫻作為華東低海拔山區(qū)重要的春花樹種，南京、杭州、武漢、南昌、上海、無錫、長(zhǎng)沙等地已對(duì)其進(jìn)行園林利用，但多為直接的野外成樹移植，這對(duì)其野生資源的自然更新造成一定的破壞，科學(xué)合理的引種繁育體系鮮見報(bào)道[3]。野外調(diào)查結(jié)果顯示，由于受人為開發(fā)、自然繁殖衰退等因素的影響，野生迎春櫻的種群數(shù)量有逐漸減少的趨勢(shì)。為合理保護(hù)和開發(fā)利用野生迎春櫻資源，建立科學(xué)快速的無性繁育體系，在前期已獲得無菌外植體的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)其組培快繁體系的建立進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，以期為迎春櫻的合理開發(fā)利用及保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在前期組培無菌外植體研究的基礎(chǔ)上，以0.2 g/L GA3處理過的迎春櫻種子為試驗(yàn)材料[4-5]，于溫度為15 ℃、光照度1 500～2 000 lx、光暗周期16 h/8 h的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d左右，以具有2張真葉的無菌沙床苗為外植體材料。

1.2 試驗(yàn)條件

培養(yǎng)室溫度為（23±2） ℃，光照度為1 500～2 000 lx，每天光照16 h。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 叢芽誘導(dǎo)與增殖試驗(yàn) 選用光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 d左右的迎春櫻沙床苗為外植體材料，剪去幼根，無菌水浸洗3遍，70%乙醇浸洗30 s后，無菌水浸洗3遍，再用0.2% HgCl2溶液浸洗3 min后，無菌水浸洗5～6遍，置于滅菌濾紙上吸干材料表面水分后，將每個(gè)材料剪成帶子葉和真葉的莖段接種于MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA的啟動(dòng)培養(yǎng)基上;培養(yǎng)室中培養(yǎng)30 d左右，選擇無菌增殖芽進(jìn)行叢芽的誘導(dǎo)與增殖。叢芽誘導(dǎo)與增殖以MS為基本培養(yǎng)基，含30 g/L蔗糖、7 g/L瓊脂粉，附加0.5～6.0 mg/L細(xì)胞分裂素6-BA、0.05～0.40 mg/L 生長(zhǎng)素NAA，pH值為5.8。采用梯度和交叉配比的方法進(jìn)行目的培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)，30 d時(shí)進(jìn)行觀測(cè)統(tǒng)計(jì)。

1.3.2 繼代壯苗試驗(yàn) 以MS為基本培養(yǎng)基[6-10]，附加 0.5 mg/L 細(xì)胞分裂素6-BA、0.05 mg/L生長(zhǎng)素NAA、0.5～2.0 mg/L GA3、4～7 g/L瓊脂粉，pH值5.8，蔗糖30 g/L，采用梯度和交叉配比的方法進(jìn)行壯苗培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)。

1.3.3 生根培養(yǎng)試驗(yàn) 分別以1/4MS、1/2MS、3/4MS、MS為基本培養(yǎng)基，附加0.2～1.0 mg/L生長(zhǎng)素NAA，采用梯度和交叉配比的方法進(jìn)行生根培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)。

1.3.4 試管苗移栽試驗(yàn) 選取生根培養(yǎng)40 d左右的健壯生根苗，分別采用開瓶煉苗5 d后移栽[11-15]和開瓶后直接移栽的方法[12]進(jìn)行試管苗的移栽試驗(yàn)，生根苗出瓶時(shí)須清水沖洗干凈，并用0.1%多菌靈蘸根處理;在參考前人試驗(yàn)的基礎(chǔ)上[13]，選用高溫滅菌過的V細(xì)沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1組成的基質(zhì)作為栽培基質(zhì)，于穴盤中生長(zhǎng)20 d后觀測(cè)統(tǒng)計(jì)試管苗移栽成活情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素配比對(duì)叢芽誘導(dǎo)與增殖的影響

沙床苗轉(zhuǎn)接至MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA初代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d時(shí)增殖系數(shù)為2.2，增殖芽數(shù)量少，難以滿足組培快繁的需要;在前期的預(yù)試驗(yàn)中，高濃度的6-BA刺激可誘導(dǎo)叢芽發(fā)生，據(jù)此筆者在初代培養(yǎng)基上，通過對(duì)6-BA、NAA的濃度進(jìn)行梯度和交叉配比的方法來探討外源激素對(duì)迎春櫻叢芽誘導(dǎo)與增殖的影響（表1）。

根據(jù)A1、B1、C1、D1、F1試驗(yàn)觀測(cè)結(jié)果，在NAA濃度為 0.10 mg/L 不變的條件下，通過對(duì)6-BA的濃度進(jìn)行梯度和交叉配比可知，在培養(yǎng)基中只有外源激素NAA的情況下，NAA起到促進(jìn)不定根產(chǎn)生的作用，6-BA在濃度為1.0 mg/L時(shí)可促進(jìn)叢芽的產(chǎn)生，隨著其濃度的逐漸提高，其作用由促進(jìn)叢芽產(chǎn)生轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)紫紅色愈傷組織產(chǎn)生（圖1），從而抑制了叢芽的產(chǎn)生;根據(jù)E1、F1、G1、H1、I1試驗(yàn)觀測(cè)結(jié)果，在 6-BA 為1.0 mg/L不變的條件下，通過對(duì)NAA的濃度進(jìn)行梯度和交叉配比可知，在培養(yǎng)基中只有外源激素6-BA的情況下，6-BA則起到促進(jìn)叢芽產(chǎn)生的作用，隨著NAA濃度的逐漸提高，NAA對(duì)迎春櫻的影響由A1中的促進(jìn)生根轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)外植體基部黃綠色愈傷組織的產(chǎn)生，從而抑制了不定根及叢芽的產(chǎn)生。由此可知，6-BA對(duì)迎春櫻的影響在于促進(jìn)其叢芽的產(chǎn)生，NAA則起到促進(jìn)其不定根產(chǎn)生的作用，高濃度的6-BA、NAA均可促進(jìn)愈傷組織的產(chǎn)生，從而抑制叢芽和不定根的產(chǎn)生。

據(jù)J1、K1、L1、M1、N1試驗(yàn)觀測(cè)結(jié)果可知，在NAA濃度為0.05 mg/L不變的情況下，6-BA濃度在0.4～0.6 mg/L時(shí)叢芽生長(zhǎng)較好，過低或過高濃度的6-BA均不利于迎春櫻外植體高生長(zhǎng)。外植體于B1、C1、D1中刺激10、40 d時(shí)轉(zhuǎn)接至L1培養(yǎng)基中，叢芽發(fā)生明顯;刺激10 d時(shí)轉(zhuǎn)接的材料隨著 6-BA 濃度的提高，叢芽增殖系數(shù)逐漸升高，其中外植體于D1轉(zhuǎn)接至L1的增殖系數(shù)最大，達(dá)17.1，部分單株增殖系數(shù)最大可達(dá)49.5，但過高刺激產(chǎn)生的叢芽生長(zhǎng)細(xì)弱，部分葉片卷縮、枯黃，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象;刺激40 d時(shí)轉(zhuǎn)接的材料隨著 6-BA 濃度的提高，叢芽增殖系數(shù)下降或無叢芽產(chǎn)生。由此可知，叢芽誘導(dǎo)與增殖試驗(yàn)時(shí)，6-BA刺激濃度不易過高，時(shí)間不易過長(zhǎng)，刺激濃度過高時(shí)，后期叢芽生長(zhǎng)不良，以2～4 mg/L 刺激濃度為宜;刺激時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，外植體轉(zhuǎn)變?yōu)橛鷤M織，后期轉(zhuǎn)接生長(zhǎng)難以誘導(dǎo)叢芽，以刺激時(shí)間10 d左右、材料未形成明顯的愈傷組織為宜。

2.2 繼代壯苗

叢芽誘導(dǎo)與增殖試驗(yàn)中6-BA刺激濃度過高容易導(dǎo)致叢芽過多，后期生長(zhǎng)出現(xiàn)叢芽細(xì)弱、葉片卷縮、枯黃、玻璃化等現(xiàn)象，同時(shí)叢芽增殖多、生長(zhǎng)快需要消耗大量水分，外植體生長(zhǎng)一段時(shí)間后容易造成培養(yǎng)基失水開裂，出現(xiàn)材料后期生長(zhǎng)衰弱的現(xiàn)象;赤霉素具有促進(jìn)細(xì)胞分裂和莖的伸長(zhǎng)的作用，瓊脂濃度則對(duì)培養(yǎng)基軟硬具有調(diào)節(jié)作用，為達(dá)到繼代壯苗的目的，在附加GA3的基礎(chǔ)上，對(duì)MS培養(yǎng)基中瓊脂濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，以篩選出適合迎春櫻后期生長(zhǎng)的壯苗培養(yǎng)基。每個(gè)處理36個(gè)材料，30 d后觀測(cè)統(tǒng)計(jì)材料生長(zhǎng)情況，具體結(jié)果見表2。

由表2可知，A2、B2、C2、D2處理中，材料葉片開展，無葉片卷縮畸形及玻璃化現(xiàn)象，除B2莖高1.5～2.5 cm外，各處理高生長(zhǎng)不明顯，處理間差別不大，均有少量的生根現(xiàn)象，B2處理材料后期生長(zhǎng)最好。據(jù)此可知GA3起到促進(jìn)迎春櫻葉片開展、減少玻璃化的現(xiàn)象，GA3濃度為1.0 mg/L時(shí)，可起到促進(jìn)迎春櫻葉片開展、莖段伸長(zhǎng)的目的。

以MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3 為基本培養(yǎng)基， 對(duì)培養(yǎng)基中瓊脂濃度進(jìn)行梯度交叉配比可知，培養(yǎng)基中瓊脂濃度≥5.5 g/L時(shí)，30 d觀測(cè)時(shí)均有不同程度的開裂現(xiàn)象，其中，瓊脂含量為7.0 g/L時(shí)，開裂率達(dá)73.3%，材料后期生長(zhǎng)減弱;瓊脂濃度降低，開裂率隨之降低。瓊脂濃度≤5.0 g/L，30 d觀測(cè)時(shí)培養(yǎng)基無開裂，有不同程度的污染現(xiàn)象;瓊脂濃度≤4.0 g/L時(shí)，培養(yǎng)基呈流質(zhì)狀或液態(tài)，接種操作困難，培養(yǎng)基容易污染，后期污染率高達(dá)90.9%，材料生長(zhǎng)畸形;瓊脂濃度為4.5～6.0 g/L時(shí)，培養(yǎng)基呈固態(tài)，接種操作容易，后期材料生長(zhǎng)旺盛，新生真葉6～8張。由此可知，培養(yǎng)基瓊脂濃度不宜過低或過高，以30～40 d不開裂為基準(zhǔn)，培養(yǎng)基中瓊脂濃度為5.0 g/L左右時(shí)，可起到繼代壯苗的目的。

外植體材料于C1中培養(yǎng)10 d后轉(zhuǎn)接至H2，30 d時(shí)觀測(cè)叢芽增殖系數(shù)為8.2，葉片開展，葉色黃綠，后期生長(zhǎng)健壯（圖2），起到叢芽誘導(dǎo)增殖及壯苗的雙重目的。

2.3 生根培養(yǎng)

由叢芽誘導(dǎo)與增殖試驗(yàn)結(jié)論可知，NAA具有促進(jìn)外植體基部產(chǎn)生不定根的作用，依據(jù)前人的相關(guān)研究通過對(duì)MS培養(yǎng)基中大量元素和NAA濃度進(jìn)行梯度和交叉配比的方法[10-13]，探討適合迎春櫻的生根培養(yǎng)基。40 d時(shí)觀測(cè)生根生長(zhǎng)情況，具體配比觀測(cè)結(jié)果見表3、圖3。

由表3可知，對(duì)MS培養(yǎng)基中的大量元素進(jìn)行梯度配比，各處理均有不同程度的生根現(xiàn)象，A3處理生根率最低，為 79.2%，40 d時(shí)根長(zhǎng)僅0.5～2.5 cm，莖高約1 cm，生長(zhǎng)緩慢;B3、C3、D3處理生根率均在90%以上，具不定根1～8條，不定根又具多數(shù)須根，米黃色或黃白色，B3、D3處理根長(zhǎng)較C3短，莖高1～2 cm，葉色墨綠，生長(zhǎng)健壯。據(jù)此可知，迎春櫻為易生根植物，MS培養(yǎng)基中不添加任何外源激素的情況下均有不同程度的生根現(xiàn)象;培養(yǎng)基中大量元素過低對(duì)迎春櫻生根及莖葉健壯生長(zhǎng)有不利影響，過高則對(duì)其生根造成一定的抑制作用，影響不定根的伸長(zhǎng)，以3/4MS培養(yǎng)基生根效果較好，但不定根細(xì)弱，移栽容易斷根。

以3/4MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，對(duì)NAA濃度進(jìn)行梯度交叉配比可知，隨著NAA濃度的提高，不定根由細(xì)變粗，生根率也逐漸提高，培養(yǎng)基中NAA濃度達(dá)0.08 mg/L時(shí)，生根率可達(dá)100.0%;NAA濃度為0.10 mg/L時(shí)，生根率雖高，但莖葉生長(zhǎng)較弱，40 d觀測(cè)時(shí)，莖高未生長(zhǎng)，莖葉發(fā)黃，逐漸失去生長(zhǎng)能力;NAA濃度≤0.02 mg/L時(shí)，不定根細(xì)弱，NAA作用不明顯。據(jù)此可知，以3/4MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，NAA濃度對(duì)迎春櫻不定根的粗細(xì)、健壯有影響，濃度過低不定根細(xì)弱，濃度過高不定根粗短，莖葉生長(zhǎng)緩慢，NAA濃度0.04～0.08 mg/L 是迎春櫻生根培養(yǎng)基的合適濃度，生根率均在91%以上，不定根較多，莖葉健壯。

2.4 生根苗的煉苗移栽

選取F3、G3、H3培養(yǎng)基中的健壯生根苗進(jìn)行煉苗移栽試驗(yàn)，采用開瓶煉苗5 d后移栽于V細(xì)沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1組成的基質(zhì)穴盤中的方法，20 d時(shí)觀測(cè)生根苗成活率為 9.4%;采用開瓶后直接移栽于V細(xì)沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1組成的基質(zhì)穴盤中的方法，將穴盤置于培養(yǎng)室（培養(yǎng)溫度、光照等條件同生根培養(yǎng)一致）中培養(yǎng)20 d時(shí)觀測(cè)生根苗成活率為93.8%，新生真葉2～3張（圖4）。

據(jù)試驗(yàn)觀測(cè)結(jié)果可知，開瓶煉苗5 d后培養(yǎng)基開裂，生根苗部分不定根暴露于空氣中，干燥失水，失去活力，同時(shí)上部葉片失水萎蔫，移栽后成活率低，這種方法不適于迎春櫻的煉苗移栽;迎春櫻為易生根植物，生根培養(yǎng)不定根良好，采用直接移栽于同等溫度、光照條件下煉苗移栽的方法，移栽后緩苗期短，污染率低，植株生長(zhǎng)健壯，生根苗成活率達(dá)93.8%，該方法較前一種方法更適于迎春櫻的煉苗移栽。

3 討論與結(jié)論

在MS+0.1 mg/L NAA為基本培養(yǎng)基的條件下，6-BA具有促進(jìn)迎春櫻叢芽產(chǎn)生的作用，濃度過高則促進(jìn)愈傷組織的產(chǎn)生。在叢芽誘導(dǎo)與增殖試驗(yàn)中，可采取前期高濃度6-BA刺激誘導(dǎo)叢芽，后期低濃度增殖生長(zhǎng)的方法進(jìn)行迎春櫻的叢芽誘導(dǎo)與增殖;前期刺激6-BA濃度以2～4 mg/L為宜，刺激時(shí)間10 d左右，后期轉(zhuǎn)接至MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)為5.9～10.7，起到叢芽誘導(dǎo)與增殖的目的，轉(zhuǎn)接至MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3+5 g/L瓊脂壯苗培養(yǎng)基上，30 d時(shí)增殖系數(shù)為8.2，起到叢芽誘導(dǎo)增殖及壯苗的雙重目的。隨著繼代次數(shù)的增多，外源激素在植物體內(nèi)不斷積累，后期叢芽誘導(dǎo)與增殖可適當(dāng)降低6-BA刺激濃度和時(shí)間。

在未附加其他外源激素的情況下，對(duì)MS培養(yǎng)基中大量元素進(jìn)行梯度配比，40 d時(shí)試管苗均有不同程度的生根現(xiàn)象，說明迎春櫻為易生根植物;以3/4MS為基本培養(yǎng)基，NAA濃度對(duì)迎春櫻不定根的粗細(xì)、健壯有影響，NAA濃度為 0.04～0.08 mg/L時(shí)，生根率為91.5%～100.0%，不定根較多，莖葉健壯，為迎春櫻的合適生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)40 d左右時(shí)，將生根苗直接開瓶移栽于V細(xì)沙 ∶ V珍珠巖 ∶ V蛭石=1 ∶ 1 ∶ 1 組成的基質(zhì)的穴盤中，20 d時(shí)成活率為93.8%，新生真葉2～3張，成活率高，生長(zhǎng)健壯;45 d左右進(jìn)行大田移栽，成活率在90%以上。

本研究表明，高濃度的6-BA可有效促進(jìn)愈傷組織的產(chǎn)生，而迎春櫻通過愈傷組織獲得胚體再生相當(dāng)困難，植物遺傳轉(zhuǎn)化的眾多研究已證明，通過愈傷組織再生系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率較高。因此，在本研究的基礎(chǔ)上，通過愈傷組織開展迎春櫻胚體再生體系研究成為開展轉(zhuǎn)基因工作的重要環(huán)節(jié)[16]，是迎春櫻組培快繁尚需攻關(guān)完善的環(huán)節(jié)，同時(shí)，為使理論更好地應(yīng)用于生產(chǎn)，迎春櫻組培苗大田移栽后，后期成活率高低、生長(zhǎng)健壯與否、個(gè)體變異情況是后續(xù)仍須深入研究的課題。

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