互葉白千層優(yōu)株篩選及叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

杜尚廣 余波

摘要：本研究以3種互葉白千層枝葉為試驗(yàn)材料，采用同時(shí)蒸餾法提取精油，通過氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用分析鑒定其化學(xué)成分。在此基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)優(yōu)株誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素種類和濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，互葉白千層品種2精油中松油醇-4含量為42.9%，1，8-桉樹油素含量為11.24%，較佳的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.05 mg/L NAA+0.15 mg/L 6-BA+0.05%活性炭+0.07 mmol/L硝酸鑭，pH值5.8，該條件下的誘導(dǎo)率是96.4%。結(jié)果表明，互葉白千層品種2是高精油優(yōu)良株系，精油成分符合國際標(biāo)準(zhǔn)（ISO4730—1996），上述叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：互葉白千層;優(yōu)株篩選;茶樹油;成分分析;叢生芽誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)： S722.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0044-04

收稿日期：2017-08-24

基金項(xiàng)目：江西省科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2015ZBBE50020）;江西省南昌市科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2014HZZC021）;江西省教育廳科技重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：GJJ181070）。

作者簡(jiǎn)介：杜尚廣（1987—），男，安徽宿州人，博士，助教，主要研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：duguangss@foxmail.com。

通信作者：余 波，教授，主要研究方向?yàn)橹参镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：yubojxie@163.com。 互葉白千層（Melaleuca alterniifolia）屬于桃金娘科（Myrtaceae）白千層屬（Melateuca）常綠小喬木，原產(chǎn)于澳洲北部沿海地帶，現(xiàn)已被大量引種到部分熱帶和亞熱帶的國家和地區(qū)[1]?；ト~白千層耐干旱貧乏及漬水地，適合種植在氣溫不低、無霜期長(zhǎng)的地區(qū)，20世紀(jì)80年代引種到我國，現(xiàn)主要分布在廣東、廣西和云南等地[2]。互葉白千層的新鮮枝葉和樹干提取的精油俗稱茶樹油，茶樹油散發(fā)出宜人的肉豆蔻香氣，能夠有效、無刺激地殺死人身體皮膚表層的真菌和細(xì)菌[3-6]，并對(duì)一些病毒具有抑制作用[7-9]，因而廣泛應(yīng)用于醫(yī)用藥品、食品防腐、護(hù)膚品、香料產(chǎn)業(yè)和農(nóng)業(yè)藥品等領(lǐng)域[10-13]。互葉白千層花色潔白聚生，樹型整齊，氣味芳香，是創(chuàng)建保健園林綠化樹種的首選，且其能夠耐濕生、抗水淹，可以固定河床[14]。所以，種植互葉白千層具有很大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。

互葉白千層可分為3種類型，松油醇-4型，桉葉油素型和混合型，現(xiàn)在能被廣為利用的是松油醇-4型[15]。而我國引進(jìn)的樹種良莠不齊，所提取的茶樹油大部分不符合國際標(biāo)準(zhǔn)，給茶樹油的生產(chǎn)和貿(mào)易帶來了許多問題。目前，國內(nèi)并沒有學(xué)者對(duì)互葉白千層系統(tǒng)地進(jìn)行優(yōu)良精油株系篩選。所以，有必要進(jìn)行優(yōu)株的篩選?；ト~白千層種子多敗育，發(fā)芽率僅10%左右，且后代易產(chǎn)生變異[16]。扦插生根率雖高，但成活率較低[17-18]。而通過快速繁殖技術(shù)獲得的組培苗由于具有產(chǎn)量高，易于生產(chǎn)管理，且能保持原有品種的優(yōu)良性狀等優(yōu)點(diǎn)，有希望成為互葉白千層產(chǎn)業(yè)化育苗的主要繁殖手段。目前，互葉白千層組培快速繁殖技術(shù)不成熟，叢生芽誘導(dǎo)率普遍較低。

為篩選獲得互葉白千層高精油產(chǎn)量?jī)?yōu)株，并解決制約優(yōu)株叢生芽誘導(dǎo)的瓶頸問題，本課題收集3種不同來源的互葉白千層株系，采用同時(shí)蒸餾法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，提取并分析精油成分，對(duì)照國際標(biāo)準(zhǔn)，選取得油率高、品質(zhì)好的優(yōu)株，再以該株系為試驗(yàn)材料，采用正交試驗(yàn)篩選出叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，為培育出大量高品質(zhì)種苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

互葉白千層：溫室栽培植株，株高20 cm，由江西撫州市森源生物科技有限公司和福建省永安市黃泥家有限責(zé)任公司提供。前者提供的材料稱為品種1，后者提供的材料有2個(gè)品種，分別稱為品種2和品種3。試驗(yàn)所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

ZY100型同時(shí)蒸餾萃取儀，上海銀澤儀器設(shè)備有限公司;ZT-50L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鄭州長(zhǎng)盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;QP5050A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司;LMQC型立式滅菌鍋，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司;SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;JY3002電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;艾柯DZG-303A超純水儀，成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司;RDX型智能人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 精油提取和理化常數(shù)測(cè)定 隨機(jī)采取互葉白千層帶葉的嫩枝，用自來水沖洗干凈，隨即陰干，剪碎至50～60 mm并封袋冷藏備用。將100 g剪碎的互葉白千層枝葉放入同時(shí)蒸餾儀一端的圓底燒瓶（1 000 mL）中，加入約800 mL蒸餾水，使用電爐加熱;裝置的另一端加入80 mL乙醚作為萃取劑，在水浴鍋上加熱，水浴溫度為34.5 ℃。蒸餾萃取的時(shí)間為4 h。蒸餾萃取完成后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去混合液中的乙醚，溫度設(shè)定為30 ℃，最后加入60 g無水硫酸鈉，干燥備用。試驗(yàn)重復(fù) 4次，取平均值。相對(duì)密度依據(jù)GB/T 11540—2008《香料 相對(duì)密度的測(cè)定》測(cè)定;折光指數(shù)依據(jù)GB/T 14454.4—2008《香料 折光指料的測(cè)定》測(cè)定;旋光度依據(jù)GB/T 14454.5—2008《香料 旋光度的測(cè)定》測(cè)定;乙醇中溶解（混）度依據(jù)GB/T 14455.3—2008《香料 乙醇中溶解（混）度的評(píng)估》測(cè)定。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜工作參數(shù) （1）色譜柱：柱箱采用程序升溫，起始溫度為60 ℃，保持2 min，之后以8 ℃/min升至 250 ℃，保持5 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，以He為載氣，其流速為0.4 mL/min，壓力為56.7 kPa，流出物分流比為 20 ∶ 1。（2）質(zhì)譜條件：質(zhì)譜電離方式為EI，接口溫度為 280 ℃，電子能量為70 eV，四級(jí)桿溫度為150 ℃，離子源溫度為230 ℃，溶劑延遲3 min。質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍為33～400 amu，電子倍增器電壓為1 941.2 V。利用檢索譜庫（NIST14.L）對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，并采用峰面積歸一化法對(duì)各樣品成分進(jìn)行定量分析。精油檢測(cè)單位是南昌大學(xué)分析檢測(cè)中心，每個(gè)樣品檢測(cè)量為1 μL。

[5]Baldissera M D，Souza C F，Júnior G B，et al. Melaleuca alternifolia essential oil enhances the non-specific immune system and prevents oxidative damage in Rhamdia quelen experimentally infected by Aeromonas hydrophila：Effects on cholinergic and purinergic systems in liver tissue[J]. Fish & Shellfish Immunology，2017，61（2）：1-8.

[6]Souza C D F，Baldissera M D，Vaucher R D A，et al. In vivo bactericidal effect of Melaleuca alternifolia essential oil against Aeromonas hydrophila：silver catfish （Rhamdia quelen） as an experimental model[J]. Microbial Pathogenesis，2016，98（9）：82-87.

[7]吳 頔，謝吉蓉，宋 琴，等. 茶樹油作為天然抗菌劑的研究進(jìn)展[J]. 中國藥學(xué)雜志，2013，48（21）：1803-1807.

[8]Pereira T S，de Santanna J R，Silva E L，et al. In vitro genotoxicity of Melaleuca alternifolia essential oil in human lymphocytes[J]. Journal of Ethnopharmacology，2014，151（2）：852-857.

[9]Garozzo A，Timpanaro R，Stivala A，et al. Activity of Melaleuca alternifolia （tea tree） oil on influenza virus a/PR/8：study on the mechanism of action[J]. Antiviral Research，2011，89（1）：83-88.

[10]Wong Y F，Davies N W，Chin S T，et al. Enantiomeric distribution of selected terpenes for authenticity assessment of Australian Melaleuca alternifolia oil[J]. Industrial Crops and Products，2015，67（5）：475-483.

[11]Baldissera M D，da Silva A S，Oliveira C B，et al. Effect of tea tree oil （Melaleuca alternifolia） on the longevity and immune response of rats infected by Trypanosoma evansi[J]. Research in Veterinary Science，2014，96（3）：501-506.

[12]Santamaria J，Petermann K D，Vedovello S A，et al. Antimicrobial effect of Melaleuca alternifolia dental gel in orthodontic patients[J]. American Journal of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics，2014，145（2）：198-202.

[13]吳麗君，陳 達(dá)，高 楠，等. 高含油互葉白千層高效栽培配套技術(shù)研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，32（7）：734-738.

[14]Shepherd M，Wood R，Raymond C，et al. Ecotype variation in early growth，coppicing，and shoot architecture of tea tree （Melaleuca alternifolia）[J]. Industrial Crops and Products，2015，76（12）：844-856.

[15]Russell M F，Southwell I A. Monoterpenoid accumulation in 1，8-cineole，terpinolene and terpinen-4-ol chemotypes of Melaleuca alternifolia seedlings[J]. Phytochemistry，2003，62（5）：683-689.

[16]Anon. Essential oils-oil of Melaeuca，terpinen-4-ol type（tea tree oil）.ISO-4730[R]. Geneva：International Organisation for Standardisation，1996.

[17]黃 戈，翁曉晨，張 帆，等. 互葉白千層的種植和加工研究進(jìn)展[J]. 廣東化工，2017，44（4）：71-73.

[18]覃子海，肖玉菲，唐復(fù)呈，等. 互葉白千層扦插繁殖技術(shù)[J]. 廣西林業(yè)科學(xué)，2017，46（1）：111-114.南程慧，薛曉明，伊賢貴，等. 迎春櫻組培快繁體系研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（1）：48-52.