法國藍薰衣草揮發(fā)油改善記憶障礙的藥效評價研究

朱麗云+高永生+宋林珍+李素芳+錢俊青

[摘要] 為研究薰衣草揮發(fā)油改善記憶障礙的潛在應(yīng)用價值，采用GC-MS技術(shù)分析了薰衣草揮發(fā)油的化學(xué)組成，并建立小鼠阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s disease， AD）模型，以跳臺實驗和腦組織中T-SOD， GSH-PX， CAT等抗氧化酶活性及其產(chǎn)物MDA含量的變化等研究了薰衣草揮發(fā)油的改善記憶障礙功能。實驗結(jié)果表明，GC-MS技術(shù)分析鑒定了薰衣草揮發(fā)油55種化學(xué)成分，主要為萜烯、萜醇和酯類化合物，樟醇和乙酸芳樟酯含量最高，占總揮發(fā)油的49.71%。薰衣草揮發(fā)油給藥組均顯著改善了小鼠跳臺記憶能力，對小鼠腦組織中GSH-PX、CAT和T-SOD水平均顯著高于模型組（P<0.05），MDA在模型組中達到最高，藥物組MDA則與正常組水平無差異，體現(xiàn)了薰衣草揮發(fā)油顯著的抗腦組織氧化活性，存在誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化應(yīng)激減少的可能性，使記憶獲得性障礙出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)的作用。

[關(guān)鍵詞] 薰衣草揮發(fā)油； 記憶障礙； 成分分析； 抗氧化酶

[Abstract] In order to study the potential application value of lavender volatile oil （LVO）， the chemical composition of the volatile oil of lavender was analyzed by GC-MS， and the mouse model of Alzheimer's disease （AD） was established. Additionally， the antioxidant enzymes activity of T-SOD， GSH-PX， CAT and MDA content were studied. Experimental results showed that 55 kinds of chemical constituents including terpene， terpene alcohol and ester compounds from LVO were identified， and the content of linalool and linalyl acetate was the highest， accounting for 49.71% of the total volatile oil. The ability of mouse platform memory was improved significantly. The levels of GSH-PX， CAT and T-SOD of mouse brain tissue in the treatment group were significantly higher than those in the model group （P<0.05）. The level of MDA reached the maximum value in the model group， while there was no notable difference between the levels of MDA in the drug group and the normal group. The result indicated the significant oxidative activity of LVO， the possibility of induced oxidative stress reduction in neurons， and the reversal effect of memory acquired disorder.

[Key word] lavender volatile oil； memory impairment； chemical composition； antioxidant enzymes activity

揮發(fā)油，一類來源于植物花、莖、葉或根等部位，經(jīng)水蒸氣蒸餾、壓榨法或CO2超臨界萃取等方法提取的具有一定香味的揮發(fā)性油狀物質(zhì)，其組成成分復(fù)雜多樣，主要含各種萜類、芳香族、脂肪族和含氮含硫化合物等。植物揮發(fā)油，廣泛分布于中藥材中，如在心腦血管改善中應(yīng)用的川穹、麝香、牛黃、花椒和石菖蒲等揮發(fā)油，在呼吸系統(tǒng)中止咳、平喘、祛痰消炎等作用發(fā)揮的陳皮、姜黃、枇杷、艾葉、麻黃等揮發(fā)油，以及改善胃腸道系統(tǒng)的枳實、高良姜等揮發(fā)油，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已得到普遍關(guān)注[1]。國內(nèi)外對揮發(fā)油在抗抑郁、緩解焦慮、抗氧化、抑菌消炎以及抗腫瘤等方面的生物活性研究十分活躍[2-3]。

薰衣草，芳香療法中的明星香草，Itai T和Buchbauer G等報道薰衣草揮發(fā)油有利于強化神經(jīng)系統(tǒng)對抗神經(jīng)疲勞和抑郁[4-5]，在癡呆病癥的芳香療法上具有理想的效果[6]，Costa等也報道了薰衣草提取物在改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用[7]，本文在分析鑒定薰衣草揮發(fā)油組成成分基礎(chǔ)上，建立AD小鼠模型，研究薰衣草揮發(fā)油對其行為學(xué)、體內(nèi)抗氧化活性等的影響，試圖從氧化應(yīng)激角度解析薰衣草揮發(fā)油對AD小鼠的記憶改善功能及作用機制，為薰衣草揮發(fā)油的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料

薰衣草花（Lavandual angustifolia flower），2016年7月初購自新疆伊犁的夏季法國藍薰衣草花，由中國計量大學(xué)植物學(xué)教研室李素芳教授鑒定，標本號為LV20160703，存放于本校海洋食品加工質(zhì)量控制技術(shù)與儀器國家地方聯(lián)合工程實驗室。

實驗動物：ICR小鼠，60只，雄性，體質(zhì)量（20.0±1.1） g，由杭州師范學(xué)院動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證SCXK（滬）2012-0002，飼養(yǎng)房溫度（23±1） ℃，相對濕度（55±2）%。遵循的程序符合國家及提供實驗動物單位的實驗動物福利規(guī)則和制度。endprint

試劑盒：總超氧化物歧化酶（T-SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）與丙二醛（MDA）等檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。

儀器：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent 6890/5973（美國安捷倫）、油浴鍋（浙江納德科學(xué)儀器有限公司）、揮發(fā)油提取儀（天宮玻璃儀器廠）、ZH-800小鼠跳臺記錄系統(tǒng)（淮安珂淮儀器有限公司）、超純水系統(tǒng)（ELGA 公司）、紫外分光光度計（日立HITACHI）、電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）等

2 試驗方法

2.1 薰衣草揮發(fā)油的提取與化學(xué)成分分析

2.1.1 水蒸氣蒸餾法提取薰衣草揮發(fā)油 取新鮮薰衣草花200 g裝于蒸餾隔板上，蒸餾瓶中加10倍的水，加熱回流2 h，利用揮發(fā)油提取器收集薰衣草揮發(fā)油，以無水亞硫酸鈉脫水干燥，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 GC-MS分析薰衣草揮發(fā)油成分 將薰衣草揮發(fā)油用無水乙醇（色譜純）稀釋100倍，過膜進樣。

GC條件：HP-5色譜柱（0.25 μm×0.25 mm×30 m）；氦氣為載氣，流速1 mL·min-1；柱溫50 ℃保持1 min，以8 ℃·min-1升溫至250 ℃，保持2 min；氣化室溫度為220 ℃；進樣量1 μL，分流比為40∶1。

MS條件：離子源為EI源，離子源溫度為230 ℃，四極桿溫度為150 ℃；溶劑延遲2 min，質(zhì)量范圍為m/z 50～500。采用美國NIST′08數(shù)據(jù)庫和揮發(fā)性成分的GC-MS定性譜庫對其進行定性定量分析，揮發(fā)油中各成分GC含量的確定為面積歸一化法。

2.2 薰衣草揮發(fā)油改善記憶障礙實驗

2.2.1 動物模型制備與跳臺試驗 將60只ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)環(huán)境為（23±1） ℃溫度和12 h循環(huán)光控實驗室，允許隨意飲用水。隨機分成6組（每組10只），即陰性對照組（control）、東莨菪堿組（scopolamine，簡寫Sco）、薰衣草揮發(fā)油低、中、高劑量組（LVO1+Sco，LVO2+Sco，LVO3+Sco）和石杉堿甲片組（huperzine+Sco，簡寫Hupz+Sco），除陰性對照組外，其他各組均采用東莨菪堿腹腔注射法建立記憶獲得性障礙模型，每只鼠腹腔注射東莨菪堿0.7 mg·kg-1·d-1，連續(xù)7 d，陰性對照組腹腔注射等量0.9%生理鹽水。每天采用跳臺法進行跳臺訓(xùn)練，24 h后復(fù)測。跳臺法實驗時，將小鼠放于跳臺儀，適應(yīng)5 min，通入36 V，2 mA交流電，記錄小鼠受刺激后跳上絕緣平臺的反應(yīng)時間和5 min內(nèi)的受電擊次數(shù)，即錯誤次數(shù)。測定10 d后各組小鼠受電擊次數(shù)。

2.2.2 給藥方式 參照Linck V M[8]和Yoshiaki Sugawara[9]等的方法并改良，將薰衣草揮發(fā)油稀釋于聚氧乙烯脫水山梨醇單油醇酯（Tween-80）中，分別配成體積百分比為1，2，3作為薰衣草揮發(fā)油低、中、高劑量組，通過放置在有機玻璃室（吸入裝置）底部但不在動物觸及范圍內(nèi)的電子蒸發(fā)器，將3組給藥組小鼠分別暴露于相應(yīng)的低、中和高劑量薰衣草揮發(fā)油蒸氣中，每天控制60 min，連續(xù)10 d。有機玻璃室內(nèi)每天以10%乙醇清潔。陽性對照組以石杉堿甲片0.07 mg·kg-1·d-1劑量灌胃方式給藥，其他飼養(yǎng)條件各組一致。給藥時間均為10 d。

2.2.3 腦組織生化指標測定 10 d后斷頸脫臼法處死小鼠，迅速剝離大腦組織，分離大腦皮質(zhì)和海馬，并于冰浴生理鹽水漂洗后濾紙拭干稱重。加冰浴生理鹽水勻漿，制成10%腦組織勻漿液，離心，取上清液進行各項生化指標測定，不能立即測定則冷凍于-20 ℃冰箱中備用。T-SOD，CAT，GSH-PX，MDA等檢測均按照南京建成生物工程研究所提供的說明書配制溶劑并測定。腦組織蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍法。

2.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所有結(jié)果表示為±s。使用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計分析。通過T檢驗確定差異性。 F值為P<0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。 Pearson相關(guān)系數(shù)和回歸分析用于評估抗氧化防御和脂質(zhì)過氧化作用之間的聯(lián)系。

3 結(jié)果與分析

3.1 薰衣草揮發(fā)油的成分分析

經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取獲得的薰衣草揮發(fā)油，為淡黃色澄清透明液體，具有薰衣草特有的清香韻。采用GC-MS技術(shù)測定，其總離子流，見圖1。

由圖可知，薰衣草揮發(fā)油各成分出峰時間集中在5～18 min，含量最高的成分有2種，在離子流圖中表現(xiàn)為平頭峰，另有十余種含量較高的成分，除此以外，其他成分較多但含量均較低。GC-MS分析結(jié)果通過檢索NIST08標準譜庫及查閱相關(guān)文獻鑒定薰衣草揮發(fā)油香氣成分共55種，見表1。

從表1可以得出，芳樟醇和乙酸芳樟酯是薰衣草揮發(fā)油中的最主要成分，分別占薰衣草揮發(fā)油總量的24.56%和25.15%，乙酸薰衣草酯4.62%，樟腦0.48%。國家標準（GB/T 12653-2008）中對薰衣草油的要求，芳樟醇量在20%～43%，乙酸芳樟酯含量在25%～47%，乙酸薰衣草酯含量在0～8%，樟腦含量在0～1.5%，由此表明新疆產(chǎn)法國藍薰衣草揮發(fā)油符合國家標準要求。對薰衣草揮發(fā)油的成分進行歸類，見表2。

從表2中可知，薰衣草揮發(fā)油中主要的成分為萜烯、萜醇和酯類，占薰衣草揮發(fā)油總量的94.58%。酯類含量最高占35.53%，依次為乙酸芳樟酯、乙酸薰衣草酯和1-辛烯-3-醇乙酸酯，在薰衣草特征花香中香氣貢獻最大的組分。萜醇含量次之，占34.56%，主要由芳樟醇、4-萜品醇、α-松油醇和異龍腦等組成。萜烯類占24.3%，在植物揮發(fā)油中主要以單萜烯和倍半萜烯兩種形式存在，β-蒎烯和β-羅勒烯是薰衣草揮發(fā)油中主要的單萜烯，α-檀香烯、β-石竹烯、蓽澄茄油萜和（E）-β-金合歡烯是薰衣草揮發(fā)油中重要的倍半萜烯，具有消炎、止痛、抗組織胺和抗過敏等作用[10-13]，萜烯類不穩(wěn)定，容易氧化導(dǎo)致薰衣草揮發(fā)油顏色變深。桉葉油醇是一種典型的醚類氧化物，在桉樹、尤加利、月桂和茶樹等精油中含量很高[10，14]。endprint

3.2 對記憶獲得性障礙小鼠行為學(xué)與生化指標測定結(jié)果分析

3.2.1 行為學(xué)實驗結(jié)果分析 小鼠跳臺記憶能力測試，見圖2，正常組小鼠5 min內(nèi)觸電次數(shù)1.5次，而模型組小鼠5 min內(nèi)觸電次數(shù)為6.04次，顯著高于正常組小鼠。將經(jīng)東莨菪堿作用后小鼠每天暴露于不同濃度的薰衣草揮發(fā)油蒸汽中60 min，持續(xù)10 d 后發(fā)現(xiàn)小鼠5 min內(nèi)觸電次數(shù)明顯比模型組下降，在1.83～2.24次，具有顯著的改善記憶能力效果，經(jīng)統(tǒng)計分析，與正常對照組小鼠無顯著差異（P<0.05）。

3.2.2 腦組織蛋白含量測定結(jié)果分析 模型組與3%薰衣草揮發(fā)油高劑量組存在顯著差異（P< 0.05），模型組小鼠腦組織蛋白含量有適當下降，但與陰性對照組、薰衣草揮發(fā)油低、中劑量組以及石杉堿甲片陽性組均無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖3。

3.2.3 腦組織生化指標測定結(jié)果分析 不同濃度薰衣草揮發(fā)油蒸汽給藥干預(yù)受東莨菪堿作用的小鼠記憶功能實驗中，分析了小鼠腦組織中T-SOD，CAT，GSH-PX活性及MDA含量，測定結(jié)果見圖4，5。

Control.陰性對照組； Sco. 東莨菪堿組； LVO1+Sco. LVO低劑量組； LVO2+Sco. LVO中劑量組； LVO3+Sco. LVO高劑量組； Hupz+Sco. 石杉堿甲片組（圖3～5同）。與單用東莨菪堿處理組相比**P<0.01（同圖4～5）。

由圖4可知，不同濃度薰衣草揮發(fā)油給藥組（低、中、高劑量組）小鼠腦組織中GSH-PX，CAT，T-SOD水平均顯著高于東莨菪堿模型組（P<0.01）， 其中低、中劑量組T-SOD水平低于空白對照組，而高劑量組高于空白對照組，但均無統(tǒng)計學(xué)差異。CAT和GSH-PX，薰衣草揮發(fā)油低、中、高劑量組和陽性藥物石杉堿甲片組與空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異。據(jù)報道，東莨菪堿導(dǎo)致記憶障礙的機制之一是氧化損傷。MDA為脂質(zhì)過氧化物，由氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)生，氧自由基不僅通過生物膜中多不飽和脂肪酸的過氧化引起損傷，且能通過脂質(zhì)氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細胞損傷，因此MDA含量常用于反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細胞損傷的情況。由圖5可知，MDA在東莨菪堿模型組中達到最高，達到（10.01±0.97）μmoL·g-1 prot，與其他組均出現(xiàn)顯著性差異（P<0.01），說明模型組小鼠在東莨菪堿作用下可能引起腦損傷，影響腦部功能。而經(jīng)過1%和3%薰衣草揮發(fā)油或陽性藥物治療的小鼠腦組織中MDA的含量均低于正常組水平（無統(tǒng)計學(xué)差異），而2%的薰衣草揮發(fā)油則與正常組呈顯著差異（P<0.05），體現(xiàn)了薰衣草揮發(fā)油顯著的抗腦組織氧化活性。這個結(jié)果與行為學(xué)研究結(jié)果具有一致性，說明薰衣草揮發(fā)油或陽性藥物石杉堿甲片均存在誘導(dǎo)神經(jīng)元氧化應(yīng)激減少的可能性，使記憶獲得性障礙出現(xiàn)扭轉(zhuǎn)的作用。

3.2.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0軟件對丙二醛MDA與總超氧化物歧化酶T-SOD、丙二醛MDA與過氧化氫酶CAT、丙二醛MDA與谷胱甘肽過氧化物酶GSH-PX之間的關(guān)系進行ANOVA方差與回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MDA與T-SOD，MDA與CAT，MDA與GSH-PX之間均存在線性正相關(guān)關(guān)系，如圖6所示。MDA與T-SOD之間擬合曲線為Y=157.642-6.908X（n=60，R2=0.614），MDA與CAT之間擬合曲線為Y=219.629-11.352X（n=60，R2=0.740），MDA與GSH-PX之間擬合曲線為Y=274.490-16.764X（n=60，R2=0.883），統(tǒng)計結(jié)果表明MDA與GSH-PX的相關(guān)性高于MDA與CAT的相關(guān)性，MDA與T-SOD的相關(guān)性較弱。

4 討論

4.1 薰衣草揮發(fā)油的主要成分及其生物活性

芳樟醇和乙酸芳樟酯是法國藍薰衣草揮發(fā)油的主要成分，另有D-苧烯、4-萜烯醇、桉葉油醇、異龍腦和石竹烯等含量較高的成分，與Gabrielal和Yap P S等報道基本一致[15-16]，但具體含量差異顯著，如Gabrielal測定的薰衣草揮發(fā)油芳樟醇（32.52%）、樟腦（3.93%）含量顯著高于本文結(jié)果，而乙酸芳樟酯（21.57%）、異龍腦（1.76%）和石竹烯（1.59%）等含量則相反。Yap P S等測定的薰衣草揮發(fā)油芳樟醇和乙酸芳樟酯含量占揮發(fā)油總量的72.98%，其他成分除石竹烯（4.81%）和異龍腦（2.57%）外，含量均為2%以下。薫衣草揮發(fā)油為植物次級代謝產(chǎn)物，隨產(chǎn)地、季節(jié)、收貨時間等不同而存在顯著差異，因此也存在功能的差異性，應(yīng)用中可根據(jù)具體用途選擇薰衣草揮發(fā)油。

芳樟醇、乙酸芳樟酯、4-萜品醇等也是解痙鎮(zhèn)痛[17]、抗菌[18-19]、抗抑郁[20]、消炎[21-22]等薰衣草揮發(fā)油功能發(fā)揮的主要成分之一。萜烯類在薰衣草揮發(fā)油中種類有26種，占24.3%，主要包括β-蒎烯、β-羅勒烯、α-檀香烯、β-石竹烯、蓽澄茄油萜和（E）-β-金合歡烯等，含量較高的β-石竹烯（4.4%）可能是有效治療癌癥，焦慮和抑郁癥的功能成分[22-23]，其他萜烯類功效尚未見報道。桉葉油醇是一種典型的醚類氧化物，在桉樹油中含量很高，常作為皮膚滲透促進劑用于皮膚給藥制劑中，且具有止咳、抗炎、保護胃粘膜等作用[10]。芳樟醇、乙酸芳樟酯、4-萜品醇、β-石竹烯和桉葉油醇等成分可能是薰衣草揮發(fā)油主要生物活性發(fā)揮的物質(zhì)基礎(chǔ)。

4.2 薰衣草揮發(fā)油改善記憶障礙相關(guān)研究

阿爾茨海默病是以記憶和認知進行性喪失為特征的年齡相關(guān)神經(jīng)退行性疾病[24]，病理性特征為前腦膽堿能神經(jīng)元的喪失和乙酰膽堿水平的明顯下降[25]，導(dǎo)致破壞性認知障礙[26]，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為記憶障礙和空間記憶喪失[27-28]，目前國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)功效顯著的藥物，常用藥物以延緩生活技能喪失、心理安慰、改善失眠不安情緒等為主，如膽堿酯酶抑制劑、抗乙酰膽堿分解酵素、心理癥狀治療和神經(jīng)元保護劑等藥物[29]。endprint

Lin等報道了薰衣草揮發(fā)油在癡呆癥中的芳香療法[30]，Lucian等研究了薰衣草揮發(fā)油對東莨菪堿誘導(dǎo)癡呆模型大鼠神經(jīng)學(xué)能力的影響，結(jié)果表明，將AD模型大鼠多次暴露于薰衣草揮發(fā)油中，顯著減少了大鼠焦慮和抑郁樣行為，有效逆轉(zhuǎn)了大鼠腦中膽堿能系統(tǒng)的功能障礙誘導(dǎo)的空間記憶缺陷[31]。Fang Y Z等發(fā)現(xiàn)多種疾病都與自由基對機體的氧化損傷有關(guān)[32]，自由基損傷理論是AD 衰老的主要學(xué)說，是導(dǎo)致其認知功能障礙的基本因素[33]。許多臨床研究報道了氧化應(yīng)激參與AD的發(fā)病機制[34-35]，癡呆動物模型中的記憶損傷與大鼠腦內(nèi)增加的氧化應(yīng)激相關(guān)[36]，氧自由基的存在可能是老年人AD發(fā)展的原因[37]。通過東莨菪堿建立小鼠AD模型，即通過東莨菪堿的氧化損傷作用使小鼠記憶功能衰退，出現(xiàn)神經(jīng)退行性反應(yīng)[38]。本研究結(jié)果表明，吸入薰衣草揮發(fā)油能改善東莨菪堿誘導(dǎo)的癡呆動物模型中的空間記憶缺陷，且使腦組織SOD，GPX和CAT等抗氧化酶參與的氧化應(yīng)激減少，從而發(fā)揮對東莨菪堿誘導(dǎo)的癡呆病癥中發(fā)生的氧化和自由基損傷的保護作用。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]endprint