銀杏二萜內(nèi)酯類化合物拮抗PAF誘導(dǎo)的血小板聚集及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

徐君+王奎龍+曹澤彧+曹亮+王振中+蕭偉

[摘要] 該研究通過對(duì)銀杏二萜內(nèi)酯類化合物拮抗PAF誘導(dǎo)的血小板凝集和神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行檢測(cè)來探討銀杏內(nèi)酯制劑治療缺血性腦卒中的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)以PAF作為血小板聚集誘導(dǎo)劑，將銀杏二萜內(nèi)酯分別加入采集的兔血中，采用比濁法檢測(cè)各化合物對(duì)血小板凝集的抑制作用；在L-谷氨酸誘導(dǎo)的原代皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷模型上采用MTT檢測(cè)細(xì)胞活率，使用熒光染料Fura-2 AM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，通過Hoechst 33258染色法檢測(cè)銀杏二萜內(nèi)酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀杏二萜內(nèi)酯類化合物中抑制PAF誘導(dǎo)的血小板凝集活性大小依次為銀杏二萜內(nèi)酯K（GK）、銀杏二萜內(nèi)酯B（GB）、銀杏二萜內(nèi)酯A（GA）、銀杏二萜內(nèi)酯C（GC）、銀杏二萜內(nèi)酯M（GM）、銀杏二萜內(nèi)酯J（GJ）和銀杏二萜內(nèi)酯L（GL）；其中GB和GK（1～100 μmol·L-1）能顯著減輕L-谷氨酸所致的細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞活率明顯提高（P<0.05），細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度明顯下降（P<0.05）和細(xì)胞凋亡率明顯減少（P<0.05）。該研究明確了銀杏二萜內(nèi)酯各化合物在抑制PAF誘導(dǎo)的血小板凝集和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)方面的活性與作用特征。

[關(guān)鍵詞] 銀杏二萜內(nèi)酯類化合物； 拮抗PAF受體； 神經(jīng)保護(hù)； 凋亡； Ca2+超載

[Abstract] To study the antagonistic effect of ginkgolide homologues on platelet-activating factor （PAF）-induced platelet aggregation and investigate its neuroprotective effect. PAF was used as a coagulant， and ginkgolides were added to the rabbit blood samples respectively. The inhibitory effect of each compound on platelet aggregation was detected by turbidimetry. In L-glutamate induced primary cortical neuron cell injury model， MTT assay was used to detect cell viability. Intracellular free Ca2+ concentration in neurons was measured by using the fluorescent Ca2+ indicator Fura-2 AM. Morphological observation and Hoechst 33258 staining were used to detect the inhibitory effect of ginkgolide on neuronal apoptosis. The results showed that the inhibitory effect on PAF-induced platelet aggregation activity in ginkgolide homologues was ginkgolide K （GK）， ginkgolide B （GB）， ginkgolide A （GA）， ginkgolide C （GC）， ginkgolide M （GM）， ginkgolide J （GJ） and ginkgolide （GL） from high to low. GB and GK （1-100 μmol·L-1） could significantly reduce the cell damage caused by L-glutamate， with survival rate increasing， intracellular calcium concentration reducing and cell morphology restoring. This paper has identified the activities and characteristics of various compounds of ginkgolide homologues on PAF-induced platelet aggregation as well as its neuroprotective effect.

[Key words] ginkgolide homologues； antagonistic to PAF receptor； neuroprotection； apoptosis； Ca2+ overload

缺血性腦卒中是指腦部供血?jiǎng)用}狹窄或堵塞引發(fā)的腦組織局部供血、供氧、供糖等不足，進(jìn)而導(dǎo)致腦組織壞死的一類疾病的總稱。缺血性腦卒中發(fā)生后，腦損傷組織內(nèi)血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）水平上升和神經(jīng)突觸過度分泌興奮性氨基酸如谷氨酸是導(dǎo)致病情繼續(xù)惡化的主要原因。高濃度PAF會(huì)引發(fā)炎癥和氧化應(yīng)激[1]，而過量的興奮遞質(zhì)會(huì)引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死[2]。目前缺血性腦卒中的主要治療方法有血壓、血糖、血氧控制相關(guān)的基礎(chǔ)治療，溶栓治療，抗凝血抗血小板治療和神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)治療[3]。其中抗凝血抗血小板藥物和神經(jīng)保護(hù)藥物是治療缺血性腦卒中藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。

銀杏萜內(nèi)酯化合物是從銀杏葉中提取的結(jié)構(gòu)相似有一定藥理活性的一類化合物，由倍半萜內(nèi)酯和二萜內(nèi)酯組成[4]，其中倍半萜內(nèi)酯白果內(nèi)酯被證明沒有明顯的抑制凝血功能，但有神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]，而二萜內(nèi)酯類成分具有廣泛的藥理活性[7]。目前已經(jīng)在銀杏葉中成功分離出到多種銀杏二萜內(nèi)酯，它們分別是銀杏二萜內(nèi)酯A（ginkgolide A，GA）、銀杏二萜內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）、銀杏二萜內(nèi)酯C（ginkgolide C，GC）、銀杏二萜內(nèi)酯J（ginkgolide J，GJ）、銀杏二萜內(nèi)酯K（ginkgolide K，GK）、銀杏二萜內(nèi)酯L（ginkgolide L，GL）、銀杏二萜內(nèi)酯M（ginkgolide M，GM）等，結(jié)構(gòu)見圖1。endprint

GB是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然PAF受體拮抗劑之一，對(duì)心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，具有開發(fā)成抗血栓和治療心腦血管疾病的潛力[8]，但對(duì)于GB以外的二萜內(nèi)酯化合物藥理活性報(bào)道較少，本文對(duì)銀杏二萜內(nèi)酯類化合物拮抗PAF誘導(dǎo)的血小板凝集和神經(jīng)保護(hù)作用進(jìn)行研究和比較。

1 材料

LG-PABER-I 血小板聚集凝血因子分析儀（北京世帝科學(xué)儀器公司）；80-2臺(tái)式低速離心機(jī)[上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠]；Sartorius分析天平（北京多利斯天平有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific公司），酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）；RF-5000型熒光分光光度計(jì)（日本島津）。

枸櫞酸鈉、二甲基亞砜（DMSO），EGTA，Triton X-100，多聚甲醛購(gòu)于南京化學(xué)試劑公司；鹽酸利多卡因購(gòu)于上海朝暉藥業(yè)；PAF：Sigma公司，用生理鹽水配成10 mg·L-1； L-谷氨酸購(gòu)于Sigma公司，用DMEM溶解至1.6 mmol·L-1并用NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至7.0過濾除菌；GA，GB，GC，GJ和GK購(gòu)于上海源葉生物公司；GL和GM由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司自行分離純化制備，用DMSO溶解；高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)于Gibco公司；磷酸緩沖液（PBS）購(gòu)于凱基生物公司；阿糖胞苷購(gòu)于上海源葉生物公司；MTT（噻唑藍(lán)）、熒光染料Fura-2 AM購(gòu)于Solarbiol公司；Hoechst 33258購(gòu)于Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（13721800）購(gòu)于Roche公司。

雄性家兔20只，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，購(gòu)于南京市青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)SCXK（蘇）2012-008；SD乳鼠購(gòu)于南京市青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，許可證號(hào)SCXK（蘇）2017-0001。

2 方法

2.1 富血小板血漿采集 取家兔2只，用利多卡因腹腔注射麻醉，手術(shù)分離頸總動(dòng)脈取血，用3.8%枸櫞酸鈉溶液以1∶9抗凝，800 r·min-1離心10 min，取上清作為富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP），剩余部分再以3 000 r·min-1離心10 min，取上清作為貧血小板血漿（platelet poor plasma，PPP）[9]。

2.2 富血小板血漿處理 用PPP調(diào)節(jié)PRP的血小板濃度至360×109～400×109 個(gè)/L，通過比濁法進(jìn)行血小板聚集實(shí)驗(yàn)。在檢測(cè)管中加入260 μL PRP和不同濃度的受試藥物30 μL（1.5 μL DMSO和27.5 μL生理鹽水），室溫孵育5 min，加入10 μL PAF（終質(zhì)量濃度為7 mg·L-1）作為誘導(dǎo)劑，觀察記錄5 min內(nèi)最大聚集率[10-11]。用等量生理鹽水作為空白對(duì)照，同時(shí)用等量生理鹽水（含1.5 μL DMSO）作溶劑對(duì)照，計(jì)算各受試化合物不同濃度下的抑制率，并通過作抑制率-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IC50。

抑制率=（對(duì)照組5 min內(nèi)最大聚集率-待測(cè)樣品組5 min內(nèi)最大聚集率）/（對(duì)照組5 min內(nèi)最大聚集率）×100% （1）

2.3 原代小鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞分離[12]及培養(yǎng) 將新生SD乳鼠（24 h內(nèi)）于-20 ℃冰箱冷凍10 min。75%乙醇消毒后斷頭取腦，在解剖液中仔細(xì)剝離腦膜，分離出皮層組織并用眼科剪剪成300～500 μm的腦片，轉(zhuǎn)移到裝有解剖液的小皿內(nèi)，加入2.5%胰蛋白酶，37 ℃消化20 min。消化結(jié)束后將組織塊取出，用含10%血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后過200目篩，細(xì)胞計(jì)數(shù)后用10%血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×109個(gè)/L。將神經(jīng)細(xì)胞接種到用10 mg·L-1多聚賴氨酸溶液處理過的培養(yǎng)板中，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

接種24 h待細(xì)胞貼壁后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，加入阿糖胞苷使其終濃度為50 μmol·L-1以抑制非神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)，作用72 h后更換含10%血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)病理研究室對(duì)原代細(xì)胞鑒定為原代皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞，第8天用于神經(jīng)細(xì)胞損傷模型實(shí)驗(yàn)。

2.4 L-谷氨酸致原代皮層神經(jīng)細(xì)胞損傷模型的建立及藥物處理 取培養(yǎng)至第8天的神經(jīng)細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次后，在無血清DMEM培養(yǎng)基分別加入終濃度為1，10，100 μmol·L-1的銀杏二萜內(nèi)酯化合物和終濃度為0.8 mmol·L-1的L-谷氨酸共同處理30 min后，換成無血清DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h[13]。

2.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取原代大腦皮層神經(jīng)以1×109個(gè)/L密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種100 μL，按上述條件培養(yǎng)8 d并按上述藥物處理方法處理細(xì)胞24 h后，每孔用PBS清洗2次，每孔加入100 μL含MTT濃度為0.5 g·L-1的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入200 μL DMSO，振蕩數(shù)5 min后采用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)吸光度。

細(xì)胞活率=（檢測(cè)組吸光度-空白培養(yǎng)基吸光度）/（空白組吸光度-空白培養(yǎng)基吸光度）×100% （2）

2.6 乳酸脫氫酶（LDH）漏出率的檢測(cè) LDH是一種穩(wěn)定的蛋白酶，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，正常情況下不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，LDH即被釋放到細(xì)胞外。乳酸脫氫酶活性測(cè)定：按上述條件培養(yǎng)8 d并按上述藥物處理方法處理細(xì)胞24 h后，收集培養(yǎng)基上清100 μL，將剩余細(xì)胞加入裂解液處理，按照試劑盒說明書分別測(cè)定上清液LDH活性和細(xì)胞裂解液的LDH活性，根據(jù)公式計(jì)算每組LDH漏出率[14]。

LDH漏出率= 培養(yǎng)基上清液LDH活力單位 /（細(xì)胞裂解液LDH活力單位+培養(yǎng)基上清液LDH活力單位）×100% （3）endprint

2.7 Fura-2 AM雙波長(zhǎng)熒光法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度[15] 神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)藥物處理24 h后，用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞懸液，加入Fura-2 AM（終濃度為5 μmol·L-1）于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩30 min，2 000 r·min-1離心5 min，用Hanks 清洗2次后混懸。采用熒光分光光度計(jì)（RF-5000型，日本島津）進(jìn)行熒光測(cè)定，F(xiàn)ura-2及其與Ca2+結(jié)合后的復(fù)合物的最大激發(fā)波長(zhǎng)分別為380，340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為500 nm，這種變化可指示Ca2+的存在及其濃度。

其中，R是實(shí)驗(yàn)中觀察到的熒光比值（F340/F380）；37 ℃時(shí)Kd為224 nmol·L-1；Rmax為神經(jīng)細(xì)胞加入0.09% Triton X-100透化后測(cè)得的F340/F380，F(xiàn)s為神經(jīng)細(xì)胞加入0.09% Triton X-100透化后在380 nm激發(fā)光下測(cè)得的Fura-2熒光強(qiáng)度（F380），Rmin為神經(jīng)細(xì)胞加入Triton X-100 透化后再加入EGTA（終濃度為3 mmol·L-1）的F340/F380，F(xiàn)0為神經(jīng)細(xì)胞加入Triton X-100透化后再加入EGTA后在380 nm激發(fā)光下測(cè)得的熒光強(qiáng)度（F380）。

2.8 Hoechst 33258 熒光染色 熒光染料Hoechst能與DNA雙鏈中的小溝結(jié)合，能夠?qū)?xì)胞核進(jìn)行標(biāo)記，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，染色質(zhì)會(huì)發(fā)生固縮，細(xì)胞核呈致密濃染，經(jīng)過Hoechst染色后，正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)出亮藍(lán)色[16]。取藥物處理細(xì)胞和正常培養(yǎng)細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基后，用4 ℃預(yù)冷的PBS 洗3 次，加入4 ℃預(yù)冷的體積比為4%的多聚甲醛溶液（用PBS溶解）于室溫固定30 min，然后用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入Hoechst 33258至終濃度為2.5 mg·L-1，并于室溫避光染色5 min。染色結(jié)束用PBS 清洗3 次，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)并拍照，同時(shí)對(duì)視野內(nèi)的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞凋亡率[17]。

2.9 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示；組間比較采用One way-ANOVA檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 銀杏二萜內(nèi)酯類化合物對(duì)PAF誘導(dǎo)的血小板凝集的影響 在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)生理鹽水組和溶劑對(duì)照組最大聚集率分別為（65.24±4.21）%，（63.58±3.53）%，各銀杏二萜內(nèi)酯化合物對(duì)PAF誘導(dǎo)家兔血小板聚集均有一定作用，并且呈量效關(guān)系，IC50見表1，其中GB和GK活性最強(qiáng)，其IC50分別為0.57，0.31 μmol·L-1，GJ，GL和GM活性較弱，IC50分別為31.5，45.5，21.0 μmol·L-1。

3.2 銀杏二萜內(nèi)酯類化合物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞活性的影響 原代乳鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)過分離培養(yǎng)后，對(duì)谷氨酸的造模劑量進(jìn)行研究后，發(fā)現(xiàn)劑量在0.8 mmol·L-1誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡最為合適。原代神經(jīng)經(jīng)L-谷氨酸（0.8 mmol·L-1）處理后，細(xì)胞活率明顯低于對(duì)照組，約為空白組55%。不同濃度的銀杏二萜內(nèi)酯和谷氨酸共同處理細(xì)胞30 min， 換液繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GA，GB和GK對(duì)細(xì)胞的保護(hù)最為明顯，在100 μmol·L-1的濃度下，細(xì)胞活率達(dá)到了空白組的75.3%，89.2%，91.3%，見表2。

3.3 銀杏二萜內(nèi)酯類化合物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）漏出的影響 LDH主要分布于活細(xì)胞的胞漿內(nèi)，正常情況下，LDH不能透過細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到損傷后，LDH被釋放到細(xì)胞外，因此可以利用LDH釋放率來判斷細(xì)胞的損傷程度，見圖2。經(jīng)L-谷氨酸處理的模型組細(xì)胞LDH漏出率明顯升高，銀杏二萜內(nèi)酯同系物對(duì)L-谷氨酸誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶泄漏都有一定的影響，其中GA，GB，GK對(duì)細(xì)胞的保護(hù)最為明顯，表明這3種化合物對(duì)L-谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

3.4 銀杏二萜內(nèi)酯類化合物對(duì)L-谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡時(shí)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響 在缺血性損傷中，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高并引發(fā)病理反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡的原因之一，有研究發(fā)現(xiàn)GB在神經(jīng)細(xì)胞興奮毒性情況下能抑制Ca2+內(nèi)流，從而保護(hù)神經(jīng)[13]，見表3。本實(shí)驗(yàn)通過Fura-2 AM 雙波長(zhǎng)熒光法對(duì)神經(jīng)細(xì)胞胞內(nèi)的Ca2+進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白組神經(jīng)細(xì)胞胞內(nèi)離子濃度較低，L-谷氨酸處理后，胞內(nèi)離子濃度約為空白組的2倍，化合物GA，GB，GC，GK（1～100 μmol·L-1）處理后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度都有劑量依賴性的降低，其中GB和GK抑制效果顯著。

3.5 銀杏二萜內(nèi)酯類化合物對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 采用Hoechst 33258 染色后可見正常神經(jīng)細(xì)胞胞核顏色均勻分散呈深藍(lán)色，用0.8 mmol·L-1 L-谷氨酸處理后，模型組細(xì)胞核大小不一，部分細(xì)胞核發(fā)生皺縮，同時(shí)伴有染色質(zhì)凝聚及核碎片出現(xiàn)，顏色為亮藍(lán)色。GA，GB，GC，GJ，GK，GL（10 μmol·L-1）處理細(xì)胞后與模型組相比，視野內(nèi)細(xì)胞凋亡率都有一定程度的降低，見表4，其中GA，GB，GK抗凋亡效果明顯，視野內(nèi)亮藍(lán)色凋亡細(xì)胞顯著減少，正常細(xì)胞數(shù)目較多，見圖3。

4 討論

PAF是在1972年由Bemrniste等[18]發(fā)現(xiàn)的一種具有生物活性的脂質(zhì)分子，研究發(fā)現(xiàn)PAF在體內(nèi) 具有類似于激素的生物活性，能作用于多種組織和細(xì)胞，除了能夠促進(jìn)血小板活化和血栓形成，還有研究表明過量的PAF可以導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和血管通透性增加。

研究發(fā)現(xiàn)GB是一類天然的PAF受體拮抗劑，GB治療腦缺血的機(jī)制主要有包括抗血小板聚集，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，抗炎癥，抗氧化等[19]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)銀杏二萜內(nèi)酯類化合物拮抗PAF受體的活性進(jìn)行研究，其中體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制血小板聚集（PAF）能力大小依次為GK，GB，GA，GC，GM，GJ，GL，實(shí)驗(yàn)表明銀杏二萜內(nèi)酯類化合物對(duì)PAF受體具有拮抗作用，不僅可以抑制血栓形成，還可以抑制PAF過度釋放導(dǎo)致的神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡、氧化損傷、血管通透性增加。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)雖然各二萜類內(nèi)酯化合物都具有相似的結(jié)構(gòu)，但活性強(qiáng)弱明顯不同，可能與它們與受體結(jié)合能力的強(qiáng)弱有關(guān)。endprint

谷氨酸是由神經(jīng)細(xì)胞突觸分泌一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，但在腦卒中、腦外傷等情況下，腦神經(jīng)細(xì)胞外液谷氨酸濃度過高，強(qiáng)烈刺激谷氨酸受體引起神經(jīng)細(xì)胞損傷和死亡。本實(shí)驗(yàn)中用0.8 mmol·L-1 L-谷氨酸處理原代皮質(zhì)神經(jīng)元后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞損傷明顯，細(xì)胞活力顯著降低，乳酸脫氫酶泄漏明顯，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。而銀杏二萜內(nèi)酯類化合物均具有不同程度的保護(hù)作用，其中GB和GK對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用明顯，尤以GK為佳，Hoechst 33258染色檢測(cè)結(jié)果顯示L-谷氨酸主要機(jī)制是誘導(dǎo)凋亡，而GB，GK能顯著抑制谷氨酸導(dǎo)致的凋亡。

本文通過對(duì)銀杏二萜內(nèi)酯類化合物體外血小板聚集抑制和神經(jīng)保護(hù)作用的研究，明確各化合物作用效果。該結(jié)果表明，銀杏二萜內(nèi)酯是銀杏類制劑治療腦卒中的有效成分，其中以GA，GB，GK活性較強(qiáng)，能夠從抑制血小板聚集和神經(jīng)保護(hù)兩方面來治療腦卒中。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 李泓. 花生四烯酸代謝、血小板激活因子、血小板膜蛋白與腦缺血 [J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)·神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊(cè)， 1996 （2）： 80.

[2] Castillo J，Davaios A，Nareiro J，et al. Neuroexcitatory amino acids and their relation to infarct size and neurological deficit in ischemic stroke [J]. Stroke， 1996， 27（6）： 1060.

[3] 林暉. 急性缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制及治療進(jìn)展 [J]. 內(nèi)科， 2012， 7（5）： 540.

[4] 惠愛玲， 吳澤宇， 袁媛， 等. 銀杏內(nèi)酯衍生物和類似物的合成及PAFR和GlyR拮抗活性研究進(jìn)展 [J]. 有機(jī)化學(xué)， 2013， 33（6）： 1263.

[5] Bruno C， Cuppini R， Sartini S， et al. Regeneration of mator nerves in bilobalide-treated rats [J]. Planta Med， 1993， 59（4）： 302.

[6] Wang Q J， Wu X F， Liu W T. Effects of ginkgolides on imitational anemic anoxic injures and secondary apoptosis of PC12 cells in vitro [J]. Chin J Nat Med， 2003， 1（4）： 213.

[7] Braquet P. The ginkgolides： potent platelet-activating factor antagonists isolated from Ginkgo biloba L.： chemistry， pharmacology and clinical applications [J]. Drugs Future， 1987， 12（7）： 643.

[8] 周春華， 盛艷樂， 趙大球， 等. 銀杏萜內(nèi)酯的生物合成研究進(jìn)展 [J]. 中藥材， 2009， 32（6）： 994.

[9] 劉成鼎， 潘蘇華， 毛黎順， 等. 銀杏內(nèi)酯B衍生物抗血小板聚集作用和作用機(jī)制 [J]. 中國(guó)天然藥物， 2009， 7（4）： 301.

[10] 張愛林，徐秋萍，孫建寧，等.復(fù)方銀杏滴丸抗血栓及抑制血小板聚集作用實(shí)驗(yàn)研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，27（1）：42.

[11] Jiang M， Bian H M. Inhibitory effects of Ginkgo bilobalide on platelet aggregation in rabbits [J]. J Nanjing Univ Tradit Chin Med， 2008， 24（3）： 197.

[12] Sasaki Y， Fukushima N， Yoshida A， et al. Low-density induced apoptosis of cortical neurons is inhibited by serum factors [J]. Cell Mol Neurobiol， 1998， 18（5）：487.

[13] 蔡衛(wèi)斌， 臧穎， 余明華. 銀杏內(nèi)酯B對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元氧化損傷的影響 [J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版， 2003， 24（3）： 256.

[14] 黃賤英. 銀杏內(nèi)酯B抗腦缺血作用及機(jī)制研究 [D]. 北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)， 2005.

[15] 宋穎，李塵遠(yuǎn)，張孟姝，等.銀杏內(nèi)酯B對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 [J].中藥藥理與臨床， 2015（5）：23.

[16] Fiedorowicz A， Figiel I， Kaminska B， et al. Dentate granule neuron apoptosis and glia activation in murine hippocampus induced by trimethyltin exposure [J]. Brain Res， 2001， 912（2）： 116.

[17] 佟彤， 尚菊菊， 解欣然，等. 心衰合劑對(duì)肥大心肌細(xì)胞凋亡及乳酸脫氫酶漏出率的影響 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志， 2013（10）： 3086.

[18] Benveniste J， Boullet C， Brink C， et al. The actions of Paf-acether （platelet-activating factor） on guinea-pig isolated heart preparations [J]. British J Pharmacol， 1983， 80（1）： 81.

[19] 高晉生， 李囿松. 銀杏內(nèi)酯B的藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 黑龍江中醫(yī)藥， 2011， 40（6）： 62.

[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint