益經(jīng)湯對(duì)卵巢功能減退模型大鼠卵巢Bcl-2、Bax 蛋白的影響※

萬云慧 陶莉莉 陳曉勇

（1 江西省婦幼保健院中醫(yī)科，江西 南昌 330006；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，廣東 廣州 510405）

卵巢功能減退 （diminished ovarian reserve，DOR）是指女性患者40 歲以前出現(xiàn)卵巢功能的減退，以月經(jīng)的異常改變（如月經(jīng)量增多或月經(jīng)量減少）、不孕為主要的臨床表現(xiàn)［1］。近年來，DOR 的發(fā)病率越來越高，越來越年輕化，如若DOR 患者得不到及時(shí)有效的治療，將最終進(jìn)展為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。目前關(guān)于DOR 病因尚不明確，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為可能與遺傳、免疫、心理及環(huán)境因素等有關(guān)［2］。目前西醫(yī)主要采取人工周期激素替代療法，人工周期療法雖然可以改善患者一系列的低雌激素癥狀，在一定程度上改善患者的生活質(zhì)量，但遠(yuǎn)期的總體效果并不十分理想。長(zhǎng)期使用，不良反應(yīng)多，如出現(xiàn)肝腎功能的異常，增加子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、靜脈血栓的風(fēng)險(xiǎn)。近年來，隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，中藥治療DOR 取得不錯(cuò)的進(jìn)展。本人以往的研究顯示加減益經(jīng)湯具有補(bǔ)腎健脾、疏肝活血的作用，能夠改善卵巢的功能，本研究將通過觀察加減益經(jīng)湯對(duì)DOR 模型大鼠卵巢顆粒細(xì)胞上Bcl-2 及Bax 蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討加減益經(jīng)湯改善卵巢功能、治療DOR 的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12 周鼠齡的清潔級(jí)成年Spragne-Dawley（SD） 雌性大鼠，體質(zhì)量約為（230±10） g。由廣東省中醫(yī)研究提供，共60 只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 加減益經(jīng)湯：熟地黃20 g，菟絲子20 g，當(dāng)歸10 g，白芍10 g，丹參15 g，黨參20 g，柴胡6 g 等9 味中藥組成。將以上藥物重復(fù)煎煮、過濾2 次，將濾液混合，然后將其濃縮為中藥高劑量含生藥2.36 g/mL，中藥中劑量含生藥1.18 g/mL，中藥低劑量含生藥0.59 g/mL，裝瓶冷卻后，低溫儲(chǔ)藏（由廣東省中醫(yī)研究所制備）。戊酸雌二醇片（補(bǔ)佳樂）：拜爾醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字J20130009。

1.3 動(dòng)物分組方法 隨機(jī)將大鼠分為空白組、模型組、中藥湯高、中、低劑量組和補(bǔ)佳樂組。

1.4 DOR 大鼠模型的建立 空白組大鼠單次腹腔注射1 mL 0.9% 生理鹽水，剩下的5 組大鼠均單次腹腔注射環(huán)磷酰胺 （CTX） 75 mg·kg-1。

1.5 給藥方法 各組大鼠都以相同的標(biāo)準(zhǔn)的飼料來飼養(yǎng)，在腹腔注射2 h 后，當(dāng)日就開始灌胃，空白組和模型組均灌胃2 mL 的0.9% 生理鹽水；中藥高劑量組：以23.6 g/kg 加減益經(jīng)湯灌胃；中藥中劑量組：以11.8 g/kg加減益經(jīng)湯灌胃；中藥低劑量組：以5.9 g/kg 加減益經(jīng)湯灌胃；補(bǔ)佳樂組：以0.09 mg/kg 補(bǔ)佳樂灌胃，1 d 1 次，連續(xù)灌胃共4 周。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)4 周灌胃結(jié)束后，處死大鼠，完整取出其卵巢組織，經(jīng)福爾馬林固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋切片，SP 法按試劑盒分別進(jìn)行免疫組化測(cè)定Bax、Bal-2及AMH 蛋白的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；多組間均數(shù)的比較，方差齊時(shí)采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較，采用LSD-t 檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用Kruskal Wallis H 法。兩兩比較采用Noparapotric Nemenyi test。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織AMH 及Bcl-2的蛋白表達(dá)降低，Bax 蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，中藥高、中劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)及AMH 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；補(bǔ)佳樂組、中藥高、中、低劑量組Bax 蛋白的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 加減益經(jīng)湯對(duì)DOR 模型大鼠卵巢組織AMH、Bcl-2 及Bax 的影響 （x±s）

3 討論

加減益經(jīng)湯是由益經(jīng)湯加減而成，益經(jīng)湯出自傅山的《傅青主女科》，其中對(duì)月經(jīng)的生理高度概括為“經(jīng)水出諸腎”，并明確列出“年未老經(jīng)水?dāng)唷薄芭悠咂叨旃锝^，有年未至七七而經(jīng)水先斷者……誰知是心肝脾之氣郁乎”。傅山所指的“年未老經(jīng)水?dāng)唷睉?yīng)為現(xiàn)代的DOR、POF，并認(rèn)為其病因病機(jī)是心肝脾氣郁，導(dǎo)致腎氣郁而不宣，不能盈滿而溢泄。治療大法為補(bǔ)腎健脾疏肝，創(chuàng)制益經(jīng)湯，組方中熟地黃、當(dāng)歸、杜仲補(bǔ)腎養(yǎng)血，黨參、白術(shù)、山藥健脾益氣，柴胡、白芍疏肝解郁，酸棗仁、牡丹皮清心，沙參補(bǔ)益肺氣，加減益經(jīng)湯在此基礎(chǔ)上加菟絲子（增強(qiáng)了補(bǔ)腎的作用），加丹參（“一味丹參，功同四物”），去白術(shù)、山藥、生棗仁、丹皮（減少了方劑藥物的組成），改人參為黨參。治療大法與益經(jīng)湯相似，全方配伍重在補(bǔ)腎健脾、疏肝活血，而兼有清養(yǎng)心肺的功效。臨床上已表明其能改善DOR 患者低雌激素癥狀，改善DOR 患者的卵巢功能［3］。經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)分析加減益經(jīng)湯中的絕大多數(shù)藥物具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌及抗衰老的功效，在治療DOR 上具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑及多系統(tǒng)的治療優(yōu)勢(shì)。

卵巢功能包括卵泡的數(shù)量和卵泡的質(zhì)量，所以DOR高度概括起來就是卵泡數(shù)量與質(zhì)量的下降。目前很多研究表明卵泡的減少與卵巢顆粒細(xì)胞（GC） 的凋亡有關(guān)，所以DOR 的發(fā)病機(jī)制之一就是GC 的凋亡，而凋亡與B 細(xì)胞淋巴瘤 （Bcl-2）/B 細(xì)胞淋巴瘤相關(guān)X 蛋白（Bax） 的比值密切相關(guān)［4］。Bcl-2 抑制顆粒細(xì)胞的凋亡，Bax 促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡，而Bax 與Bcl-2 通過形成異源或同源的二聚體，共同調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的凋亡。當(dāng)Bax 與Bcl-2 形成異源二聚體時(shí)，即Bc1-2 比Bax 的比例大時(shí)，則抑制顆粒細(xì)胞的凋亡；當(dāng)Bax 與Bcl-2 形成同源二聚體時(shí)，即Bax 與Bc1-2 的比值大時(shí)，則促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡［5-6］。

張永芳等［7］通研究發(fā)現(xiàn)CTX 能夠使大鼠的動(dòng)情周期發(fā)生紊亂，升高FSH 及LH 水平，降低AMH 及E2水平，升高卵巢組織Caspase-3 蛋白表達(dá)，降低Bcl-2 蛋白表達(dá)，卵巢間質(zhì)組織纖維化，認(rèn)為CTX 通過使大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、卵巢間質(zhì)損傷及纖維化而導(dǎo)致大鼠的卵巢功能衰竭。王雪峰等［4］認(rèn)為卵巢早衰的病機(jī)是卵泡的過快衰竭，卵泡顆粒細(xì)胞的存亡則取決于Bcl-2/Bax 的比值，Bcl-2/Bax 在卵巢功能的變化中發(fā)揮著極其關(guān)鍵的作用。劉惠芳等［8］通過觀察大鼠腹腔注射CTX 后，大鼠卵巢組織中的原始卵泡的數(shù)目明顯減少，從而導(dǎo)致大鼠卵巢功能下降。很多學(xué)者［9-11］認(rèn)為卵母細(xì)胞的凋亡及顆粒細(xì)胞的凋亡介導(dǎo)了卵泡的閉鎖是造成卵巢儲(chǔ)備功能下降的根本原因。

此實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)CTX 造模后，大鼠卵巢組織上的Bax 表達(dá)上升，Bcl-2 蛋白表達(dá)及AMH 均下降，提示模型組卵巢顆粒細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)的降低及Bax 蛋白表達(dá)的升高有可能加速卵泡的過早凋亡，從而導(dǎo)致了DOR，并由此推測(cè)CTX 引起DOR 的機(jī)制之一與卵巢的卵泡的凋亡有關(guān)。與模型組比較，中藥高、中劑量組Bcl-2 蛋白表達(dá)及AMH 升高，補(bǔ)佳樂組、中藥高、中、低劑量組Bax 蛋白的表達(dá)降低，提示補(bǔ)佳樂和加減益經(jīng)湯能夠通過增加卵巢顆粒細(xì)胞上Bcl-2 蛋白的表達(dá)，降低Bax 蛋白的表達(dá)，從而抑制卵泡的過快、過早地凋亡，以進(jìn)一步起到治療DOR 的作用。

綜上所述，DOR 的發(fā)病機(jī)制可能與Bcl-2 蛋白低表達(dá)和Bax 高蛋白表達(dá)導(dǎo)致卵泡過快、過早的凋亡有關(guān)。加減益經(jīng)湯能夠通過調(diào)控Bcl-2/Bax，即下調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá)，從而抑制卵泡的過早、過快凋亡，可能是加減益經(jīng)湯改善卵巢的功能，治療DOR 的機(jī)制之一。