大白菜根腫病菌生理小種鑒定研究

張淑霞 張清霞 司朝光 李 劍 王殿純 楊曉云*

（1 青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東青島 266100；2 青島國(guó)際種苗有限公司，山東青島 266100）

大白菜根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的一種世界性病害。該病為土傳性真菌病害，受侵染的根組織發(fā)生異常并大量增生，膨大形成瘤狀腫根，根系正常生理機(jī)能受到影響，導(dǎo)致根系生長(zhǎng)和吸收能力受損，造成減產(chǎn)或絕收。該病自1936 年在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)發(fā)現(xiàn)已來(lái)，目前全國(guó)大部分地區(qū)均有發(fā)生，對(duì)大白菜生產(chǎn)造成極大破壞。由于該病菌休眠孢子囊能在無(wú)寄主的土壤中存活7 a 以上，田間一經(jīng)發(fā)病將長(zhǎng)期帶菌，嚴(yán)重威脅大白菜的可持續(xù)生產(chǎn)，而田間栽培防范、化學(xué)藥劑防治該病效果不佳，因此選用抗病品種就成為防治該病的有效方法。

Honig（1931）首次證實(shí)根腫病菌存在生理小種分化。目前國(guó)際上通用的生理小種鑒別系統(tǒng)有兩個(gè)：Williams 鑒別系統(tǒng)（Williams，1966）和歐洲根腫病鑒別系統(tǒng)（ECD）（原玉香 等，2017）。由于后者鑒別品種多達(dá)15 個(gè)，鑒定用植株多、所需空間大等原因影響了其應(yīng)用；前者的鑒別品種只有4個(gè)，易于操作，結(jié)果計(jì)算簡(jiǎn)單，因而應(yīng)用較多。國(guó)內(nèi)大多數(shù)應(yīng)用Williams 鑒別系統(tǒng)對(duì)大白菜根腫病菌進(jìn)行生理小種鑒定的報(bào)道，均發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)致病力小種4 號(hào)生理小種（丁云花 等，2013；劉峰 等，2013；彭宇龍 等，2018）。但原玉香等（2017）使用ECD鑒別系統(tǒng)鑒定時(shí)認(rèn)為4 號(hào)生理小種可進(jìn)一步劃分為不同的類型。Kuginuki 和Yasuhisa（1999）認(rèn)為，Williams 鑒別系統(tǒng)和ECD 鑒別系統(tǒng)在鑒定時(shí)表現(xiàn)出波動(dòng)而不能區(qū)分出病菌的差別。青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院大白菜課題組前期利用Williams 鑒別系統(tǒng)對(duì)采自全國(guó)大白菜主產(chǎn)區(qū)及青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的16 份大白菜根腫病菌菌源進(jìn)行生理小種鑒定，并用已育成的抗根腫病大白菜品種同時(shí)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表現(xiàn)為4 號(hào)生理小種居多，但是卻出現(xiàn)了抗4 號(hào)生理小種的大白菜品種對(duì)來(lái)自其他地區(qū)的4 號(hào)生理小種表現(xiàn)感病的情況。這說(shuō)明4 號(hào)生理小種本身可能存在致病力的分化，或是該鑒別系統(tǒng)未能精確鑒定出生理小種的種類。本試驗(yàn)繼續(xù)采用Williams 鑒別系統(tǒng)，同時(shí)選用具有不同根腫病抗性的大白菜品種對(duì)來(lái)源不同的20 份大白菜根腫病菌進(jìn)行致病力分化的研究，旨在為大白菜根腫病菌生理小種的精確劃分和抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試根腫病菌菌源采自全國(guó)多地，代號(hào)及來(lái)源詳見(jiàn)表2。所有菌源均經(jīng)過(guò)鏡檢，觀察到休眠孢子囊和游動(dòng)的休眠孢子，確認(rèn)為蕓薹根腫菌；-20 ℃冰箱保存。

Williams 鑒別系統(tǒng)的4 個(gè)鑒別寄主分別為結(jié) 球 甘 藍(lán)Jersey Queen 和Badger shipper， 蕪 菁Laurentian 和Wilhelmsburger（表1）。

抗根腫病大白菜品種為青研CR20（青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）、金錦（福州建農(nóng)播王種苗有限公司）、德高CR117（德州市德高蔬菜種苗研究所）、青研CCR69（青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）；感病對(duì)照（CK）為青研春白1 號(hào)（青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2018 年8 月20 日至9 月25 日在青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院育苗溫室內(nèi)進(jìn)行。將保存于-20 ℃冰箱內(nèi)的菌根解凍，采用菌土法進(jìn)行接種。具體步驟：按0.02∶1（質(zhì)量比）的比例將經(jīng)攪拌機(jī)打碎后的菌根放入基質(zhì)（品氏托普育苗基質(zhì)）中混勻過(guò)夜，第2 天將基質(zhì)裝入72 孔穴盤中，播種。每個(gè)處理10 株，3 次重復(fù)。溫室溫度保持在22～28 ℃，接種35 d 后進(jìn)行病情調(diào)查。

1.3 病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及Williams 鑒別系統(tǒng)生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考丁云花和簡(jiǎn)元才（2005）的標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，無(wú)癥狀；1 級(jí)，側(cè)根有小腫瘤；3 級(jí)，側(cè)根和主根上有較大腫瘤，呈圓形；5 級(jí)，側(cè)根和主根上有大腫瘤，呈紡錘形；7 級(jí)，側(cè)根和主根上的紡錘形腫瘤連成片；9 級(jí)，腫瘤擴(kuò)展至下胚軸，側(cè)根和主根全部為大塊腫瘤。

根據(jù)各根腫病菌菌源對(duì)Williams 鑒別系統(tǒng)4 個(gè)鑒別寄主的抗感反應(yīng)來(lái)確定其生理小種類型 （表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Williams 鑒別系統(tǒng)鑒定結(jié)果

從表2 可以看出，20 份大白菜根腫病菌菌源對(duì)Williams 鑒別系統(tǒng)的4 個(gè)鑒別寄主均有很強(qiáng)的致病力，除13 號(hào)菌源和17 號(hào)菌源為2 號(hào)生理小種外，其他18 份菌源均為4 號(hào)生理小種，說(shuō)明4 號(hào)生理小種在參試根腫病菌菌源中數(shù)量最多、分布 廣泛。

表1 Williams 鑒別系統(tǒng)

表2 20 份大白菜根腫病菌菌源生理小種鑒定結(jié)果

2.2 抗根腫病大白菜品種對(duì)不同根腫病菌菌源的抗性表現(xiàn)

從表3 可以看出，4 個(gè)不同育種單位選育的抗根腫病大白菜品種對(duì)20 份根腫病菌菌源的抗性反應(yīng)可以劃分為6 個(gè)類別。其中，SSSS 類型包括的菌源最多，共9 份，占參試菌源的45%；其次為TTST 類 型，4 份；PTST 類 型 為3 份，STSP 類 型為2 份，PPSS 類型和TTPT 類型均為1 份。以上結(jié)果說(shuō)明由Williams 鑒別系統(tǒng)劃分為同一生理小種的根腫病菌菌源對(duì)于不同大白菜抗病品種的致病力表現(xiàn)并不一致，根據(jù)4 個(gè)抗根腫病大白菜品種的抗性鑒定結(jié)果可進(jìn)一步將4 號(hào)生理小種劃分為6 個(gè)不同的致病類型：菌源6、8、9、10、12、14、15、16、19 號(hào)的致病力最強(qiáng)（SSSS 類型），致病力最弱的是4 號(hào)菌源（TTPT 類型）。由Williams 鑒別系統(tǒng)鑒定為2 號(hào)生理小種的菌源13 號(hào)和17 號(hào)對(duì)4 個(gè)抗根腫病大白菜品種的致病力表現(xiàn)亦不同，分別為TTST 類型和PTST 類型，而菌源13 號(hào)與4 號(hào)生理小種的菌源1、3、5 號(hào)對(duì)抗根腫病大白菜品種的表現(xiàn)型相同，菌源17 號(hào)與4 號(hào)生理小種的菌源2、7號(hào)的表現(xiàn)型相同。

表3 4 個(gè)抗根腫病大白菜品種對(duì)不同根腫病菌菌源的抗性鑒定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)十字花科根腫病的發(fā)生逐年嚴(yán)重，面積不斷擴(kuò)大，選用優(yōu)質(zhì)高抗品種成為防治該病的最佳途徑。抗病育種的首要前提是弄清病原菌的生物學(xué)特性及致病性。國(guó)內(nèi)使用Williams 鑒別系統(tǒng)已鑒定出的根腫病菌生理小種有2 號(hào)、4 號(hào)、7 號(hào)、10 號(hào)和11 號(hào)，其中以4 號(hào)居多。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同的抗根腫病大白菜品種對(duì)來(lái)源不同的4 號(hào)生理小種表現(xiàn)出不同的抗性，說(shuō)明Williams 鑒別系統(tǒng)中鑒別寄主品種過(guò)少難以精細(xì)區(qū)分根腫病菌菌源的差異，另一方面也可能是鑒定所用的根腫病菌菌源不是單孢系，而是兩個(gè)或多個(gè)生理小種的混合物，致病力不同的生理小種所占比例不同造成對(duì)寄主品種的致病性不同。

這種鑒定為同一生理小種但對(duì)不同大白菜品種抗性表現(xiàn)不同的情況在前期試驗(yàn)中也多次出現(xiàn)，因此本次試驗(yàn)增加4 個(gè)大白菜品種作為輔助鑒別寄主共同進(jìn)行生理小種的鑒定工作。結(jié)果同為4 號(hào)生理小種的18 份根腫病菌菌源根據(jù)對(duì)4 個(gè)大白菜品種的不同抗感反應(yīng)劃分成6 種致病力不同的類型，同為2 號(hào)生理小種的13 號(hào)和17 號(hào)菌源也被劃分成2種類型。這一方面表明參試的根腫病菌菌源中可能存在比4 號(hào)生理小種致病力更強(qiáng)的菌株，Williams鑒別系統(tǒng)已不能精確劃分，這與原玉香等（2017）的研究結(jié)果相似；另一方面，菌樣未進(jìn)行單孢分離，可能是多個(gè)小種的混合體，這也造成生理小種劃分上的困難。本試驗(yàn)中使用的大白菜品種是在以往多次試驗(yàn)的基礎(chǔ)上篩選出來(lái)的，抗病基因分子標(biāo)記鑒定也表明這4 個(gè)品種分別具有不同的抗根腫病基因（待發(fā)表），今后根腫病菌生理小種劃分試驗(yàn)中可以考慮使用與抗根腫病基因分子標(biāo)記鑒定結(jié)果相對(duì)應(yīng)的高代自交系或DH 系，鑒定結(jié)果將更穩(wěn)定、可靠，同時(shí)與快速簡(jiǎn)便的單孢分離培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，才能更好地劃分根腫病菌生理小種，為抗病育種提供良好的保證。