美洲大蠊抗肝纖維化活性部位酶解制備工藝的水解蛋白酶篩選Δ

楊華蕊，楊永壽，肖培云（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南大理 671000）

美洲大蠊（Periplaneta americana L.）作為我國傳統(tǒng)藥用昆蟲，其性寒，味咸，歸肝、脾、腎經(jīng)，古人稱之為“蜚蠊”，是地球上起源最早、生命力最頑強的昆蟲類群之一[1]?，F(xiàn)代研究表明，美洲大蠊中含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、核苷、甾體和萜類等多種活性物質(zhì)[2-3]，具有抗腫瘤、保肝、促進組織修復(fù)、增強機體免疫力、抗氧化等藥理作用[4-6]。多項研究證實，美洲大蠊提取物可不同程度地抑制肝纖維化相關(guān)因子的含量，改善肝功能，從而抑制肝纖維化的進展[7-8]。本課題組一直致力于美洲大蠊的開發(fā)研究，前期研究已優(yōu)化獲得美洲大蠊脫脂膏提取工藝，并擬進一步對脫脂膏進行分離純化以獲得抗肝纖維化活性部位。然而，美洲大蠊脫脂膏提取率雖然較高（可達14.06%），但其抗肝纖維化活性部位提取率卻偏低（僅0.54%）[9]，不利于后期的開發(fā)利用。

自20世紀(jì)以來，酶化學(xué)與多學(xué)科的交叉研究得到了迅速發(fā)展和應(yīng)用，特別是在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域發(fā)揮了巨大作用[10]。酶解技術(shù)被常用于動物類藥材的提取。動物類藥材的物質(zhì)基礎(chǔ)多為小分子肽類，在提取過程中引入酶解技術(shù)，可將蛋白質(zhì)、多肽等大分子物質(zhì)酶解為能被更好地吸收入血的小肽類物質(zhì)，有利于提高動物類藥材活性成分的提取效率并改善其藥理活性[11-14]。由于不同的蛋白酶具有不同的專一性和切割位點，所得到的酶解產(chǎn)物中肽類物質(zhì)的氨基酸序列也各異[15]，因此本研究通過對5種常用蛋白酶進行考察，擬篩選出最適于美洲大蠊中抗肝纖維化活性部位酶解制備工藝的水解蛋白酶，為后續(xù)酶解制備抗肝纖維化活性部位提供工藝基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

AL204-IC型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SN255939型多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；5510E型CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國NuAire公司）；SK5200H型超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；4500A型多功能粉碎機（永康市艾澤拉電器有限公司）；TU1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 試劑

胰蛋白酶（TR，250 U/mg）、胃蛋白酶（PE，250 U/mg）、堿性蛋白酶（AL，200 U/mg）、木瓜蛋白酶（PA，6 000 U/mg）、中性蛋白酶（NE，200 000 U/mg）、pH 7.4磷酸鹽緩沖液（PBS）、四甲基偶氮唑藍（MTT）均購自北京索萊寶科技有限公司；酪氨酸對照品、小牛血清白蛋白對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為111577-200201、140619-201723，純度均為100%）；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）；HP20大孔樹脂（20～60目，廊坊淼陽化工有限公司）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為蒸餾水。

1.3 藥材

美洲大蠊藥材（批號：20140109）由云南省大理州彌渡縣美蠊養(yǎng)殖基地提供，經(jīng)云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室楊自忠教授鑒定為昆蟲綱蜚蠊科昆蟲美洲大蠊（Periplaneta americana L.）的干燥蟲體。

1.4 細(xì)胞

大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細(xì)胞庫。

2 方法與結(jié)果

2.1 美洲大蠊脫脂膏的制備

稱取美洲大蠊藥材適量，粉碎，過2號篩，按料液比1∶5（g/mL）加入70%乙醇，于80℃加熱提取3次，每次2.5 h。合并提取液，減壓濃縮至約1.3 g/cm3，石油醚脫脂，即得。

2.2 脫脂膏酶解工藝

取“2.1”項下制備的美洲大蠊脫脂膏適量，用水稀釋至溶液密度為1.07 g/cm3，調(diào)節(jié)溶液溫度至酶解反應(yīng)溫度后，用1 mol/mL氫氧化鈉溶液或濃鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至所需值；加入不同種類蛋白酶，在一定溫度條件下酶解反應(yīng)一定時間（具體酶解反應(yīng)條件[16-20]見表1）；反應(yīng)結(jié)束后于沸水浴中滅酶10 min。酶解液在室溫下放置冷卻，用1 mol/mL氫氧化鈉溶液或濃鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至中性。另設(shè)一組不加蛋白酶的脫脂膏溶液，同法操作，得對照反應(yīng)液。

表1 酶解反應(yīng)條件Tab 1 Conditions for enzymatic hydrolysis

2.3 不同蛋白酶的酶解活性考察

2.3.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的酪氨酸對照品0.5 mg，置于10 mL量瓶中，加0.02 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL，超聲（功率：200 W，頻率：53 kHz，下同）使溶解，加水定容，混勻，得酪氨酸對照品溶液。采用茚三酮法[21]進行測定：精密移取上述對照品溶液0.20、0.50、1.00、1.50、1.80、2.00 mL，分別置于10mL量瓶中，加0.2 mol/L檸檬酸緩沖液（檸檬酸4.202 g，以水40 mL溶解后，用1 mol/mL氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0，加水稀釋至100 mL，即得）1.0 mL、1%茚三酮試液（茚三酮0.5 g，以適量無水乙醇超聲溶解后定容至50 mL，即得）1.0 mL，搖勻，沸水浴中加熱30 min，取出，冷卻，再加60%乙醇3.0 mL，用水定容至刻度，搖勻。以水為空白，用紫外可見分光光度計在570 nm波長處測定吸光度，以酪氨酸質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝56.978x+0.008 3（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，酪氨酸質(zhì)量濃度在1.0～10.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3.2 小牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取小牛血清白蛋白對照品適量，以水配制成質(zhì)量濃度為0.203 mg/mL的對照品溶液。采用福林酚法[22]進行測定：精密移取上述對照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、1.8、2.0 mL，置于10 mL量瓶中，加福林酚試劑A液1.0 mL，混勻，35℃反應(yīng)10 min，冷卻；然后快速加入福林酚試劑B液4.0mL，混勻，55℃反應(yīng)15 min，冷卻；用水定容至刻度，搖勻。以水為空白，在762.2 nm波長處測定吸光度，以白蛋白質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝18.867x+0.055 2（r＝0.999 4）。結(jié)果表明，白蛋白質(zhì)量濃度在4.06～40.60 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

2.3.3 美洲大蠊脫脂膏及其酶解液中游離氨基肽氮的含量測定 取“2.1”項下制得的美洲大蠊脫脂膏及其按“2.2”項下酶解工藝制得的5種酶解液適量，用水稀釋至適當(dāng)濃度，按“2.3.1”項下茚三酮法測定，并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算酪氨酸含量；參照文獻[23]，以酪氨酸/游離氨基肽氮的轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.662計算樣品中游離氨基肽氮含量。試驗重復(fù)3次。結(jié)果顯示，美洲大蠊脫脂膏中游離氨基態(tài)氮含量為（19.55±0.57）%；NE和PA酶解液中游離氨基態(tài)氮含量較高，分別為（23.7±0.52）%、（23.29±0.71）%；AL和TR酶解液其次，游離氨基態(tài)氮含量分別為（21.8±0.22）%、（19.74±0.64）%；PE酶解液中游離氨基態(tài)氮含量最低，僅為（17.21±0.16）%。

2.3.4 不同蛋白酶水解度的測定 采用“2.3.2”項下福林酚法測定樣品的吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算美洲大蠊脫脂膏中的蛋白質(zhì)含量，并以此推算出其總氮量為45.98%；然后結(jié)合“2.3.3”項下測得的美洲大蠊脫脂膏及其酶解液的游離氨基態(tài)氮量，按公式計算各蛋白酶水解度[21]：水解度（%）＝已水解肽鍵數(shù)/蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)×100%＝（A－C）/（B－C）×100%（式中，A為各蛋白酶水解液中游離氨基態(tài)氮量，B為美洲大蠊脫脂膏的總氮量，C為美洲大蠊脫脂膏中游離氨基態(tài)氮量）。結(jié)果顯示，NE水解度為15.70%，表明其酶解能力最強；PA水解度為14.15%，其酶解能力次之；AL水解度為8.51%，酶解能力較弱；TR和PE的水解度均小于1%，幾乎沒有酶解能力。

2.4 不同蛋白酶解液的分離純化得率考察

取“2.2”項下美洲大蠊脫脂膏的各酶解液及對照反應(yīng)液，經(jīng)HP20大孔樹脂分離純化：按1/6柱體積（BV）的量上樣吸附10 h后，分別以體積分?jǐn)?shù)為50%、60%、70%、95%的乙醇按0.025 BV/min流速進行洗脫，洗脫溶劑用量均為2 BV[9]。各洗脫部位經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，計算得率。采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析；方差齊時，兩組間比較采用最小顯著法（LSD）檢驗；方差不齊時則采用Tamhanes T2法檢驗，結(jié)果見表2。

由表2可見，各酶解液的50%乙醇洗脫部位得率最高，均在9%以上；60%乙醇洗脫部位的得率次之，在2%左右；70%、95%乙醇洗脫部位的得率相對較低。對不同蛋白酶解液進行橫向比較后結(jié)果顯示，50%乙醇洗脫部位得率大小排序依次為NE＞AL＞PE＞PA＞TR＞對照反應(yīng)液；60%乙醇洗脫部位得率大小排序依次為TR＞PA＞AL＞PE＞NE＞對照反應(yīng)液；70%乙醇洗脫部位得率大小排序依次為NE＞AL＞PA＞TR＞對照反應(yīng)液＞PE；95%乙醇洗脫部位得率大小排序依次為PA＞NE＞AL＞對照反應(yīng)液＞TR＞PE。其中，經(jīng)PA、NE、AL酶解后所得反應(yīng)液的95%乙醇洗脫部位得率較對照反應(yīng)液有所提高，提高率分別為30.36%、16.07%、14.29%；經(jīng)PE、TR酶解后所得反應(yīng)液的95%乙醇洗脫部位得率較對照反應(yīng)液有所降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 不同蛋白酶解液分離純化洗脫部位得率比較（±s，n＝3，%%）Tab 2 Comparison of yield of the elution parts isolated and purified from different protease hydrolyzates（±s，n＝3，%%）

表2 不同蛋白酶解液分離純化洗脫部位得率比較（±s，n＝3，%%）Tab 2 Comparison of yield of the elution parts isolated and purified from different protease hydrolyzates（±s，n＝3，%%）

注：與對照反應(yīng)液比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.control reaction liquid，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

酶解液對照反應(yīng)液PA酶解液PE酶解液NE酶解液TR酶解液AL酶解液洗脫部位95%乙醇0.56±0.02 0.73±0.04＊＊0.45±0.02＊＊0.65±0.01＊0.51±0.07 0.64±0.05＊50%乙醇9.14±1.74 9.75±0.61 10.05±1.42 10.54±0.82 9.62±0.39 10.40±0.16 60%乙醇2.11±0.11 2.68±019＊＊2.35±0.11＊2.25±0.25 2.72±0.12＊＊2.44±0.10＊70%乙醇0.48±0.07 0.55±0.09 0.45±0.05 0.60±0.18 0.54±0.08 0.55±0.23

2.5 不同蛋白酶解液洗脫部位對HSC-T6細(xì)胞的體外抑制活性考察

2.5.1 藥物溶液的配制 精密稱取“2.4”項下所得各洗脫部位凍干粉適量，用DMSO溶解配成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的溶液，用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至300 μg/mL后，用0.22 μm的無菌微孔濾頭濾過；濾液用含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基依次稀釋為110、120、130、140 μg/mL（給藥劑量根據(jù)前期預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置），現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.5.2 分組、給藥及抑制率的檢測 取對數(shù)生長期的HSC-T6細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至8×104個/mL，按100 μL/孔接種于96孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱（以下培養(yǎng)條件相同）培養(yǎng)24 h后，棄去上清液。將細(xì)胞隨機分為空白組、正常組和不同劑量給藥組，空白組不加細(xì)胞和藥液、正常組加細(xì)胞但不加藥液（均加入等量空白培養(yǎng)基，各給藥組分別加入“2.5.1”項下配制的不同質(zhì)量濃度的藥物溶液。各組均設(shè)5個復(fù)孔。各組細(xì)胞分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，棄去上清液，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL；繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入DMSO 150μL，搖勻，使紫色結(jié)晶溶解。采用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測各孔光密度（OD）值。根據(jù)公式計算各洗脫部位對HSC-T6細(xì)胞增殖的抑制率：抑制率（%）＝[1－（給藥組平均OD值－空白組平均OD值）/（正常組平均OD值－空白組平均OD值）]×100%。

2.5.3 各蛋白酶解液的不同洗脫部位對HSC-T6細(xì)胞的抑制作用分析 結(jié)果顯示，在試驗劑量范圍內(nèi)，5種酶解液及對照反應(yīng)液的50%、60%、70%乙醇洗脫部位對HSC-T6細(xì)胞的抑制率均較低，個別洗脫部位還呈現(xiàn)促細(xì)胞增長現(xiàn)象（即抑制率為負(fù)值）；而95%乙醇洗脫部位對HSC-T6細(xì)胞的抑制率（均在20%以上）較其他洗脫部位更高，且與給藥劑量呈正相關(guān)，表現(xiàn)出較好的細(xì)胞增殖抑制效果。不同洗脫部位作用不同時間時對細(xì)胞增殖的抑制率見圖1～圖3。

圖1 不同洗脫部位作用24 h時HSC-T6細(xì)胞的抑制率Fig 1 Inhibitory rates of different elution parts on HSC-T6 cells at 24 h

圖2 不同洗脫部位作用48 h時HSC-T6細(xì)胞的抑制率Fig 2 Inhibitory rates of different elution parts on HSC-T6 cells at 48 h

2.5.4 各蛋白酶解液的95%乙醇洗脫部位對HSC-T6細(xì)胞的抑制作用分析 與對照反應(yīng)液的95%乙醇洗脫部位比較，PA酶解液的95%乙醇洗脫部位在作用24、48、72 h時對HSC-T6細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50，經(jīng)SPSS 17.0軟件計算獲得）有所降低，NE、AL、TR酶解液的95%乙醇洗脫部位的IC50值較為接近，而PE酶解液的95%乙醇洗脫部位的IC50值明顯增加。結(jié)合“2.4”項下的95%乙醇洗脫部位的得率綜合考慮，最終選擇NE、PA作為美洲大蠊脫脂膏抗肝纖維化部位酶解工藝的水解蛋白酶。不同酶解液的95%乙醇洗脫部位作用不同時間對HSC-T6細(xì)胞的影響見表3～表5。

圖3 不同洗脫部位作用72 h時HSC-T6細(xì)胞的抑制率Fig 3 Inhibitory rates of different elution parts on HSC-T6 cells at 72 h

表3 不同酶解液的95%%乙醇洗脫部位作用24 h時對HSC-T6細(xì)胞的影響（±s，n＝5）Tab 3 Effects of 95%%ethanol elution parts from different hydrolyzates on HSC-T6 cells at 24 h（±s，n＝5）

表3 不同酶解液的95%%乙醇洗脫部位作用24 h時對HSC-T6細(xì)胞的影響（±s，n＝5）Tab 3 Effects of 95%%ethanol elution parts from different hydrolyzates on HSC-T6 cells at 24 h（±s，n＝5）

IC50，μg/mL IC50，μg/mL 112.3劑量，μg/mL 110 120 130 140 150劑量，μg/mL 110 120 130 140 150劑量，μg/mL 110 120 130 140 150 IC50，μg/mL 123.0 IC50，μg/mL 120.0130.2對照反應(yīng)液抑制率，%25.63 46.59 63.37 76.81 86.84 NE酶解液抑制率，%39.17 42.72 65.43 82.26 89.96 AL酶解液抑制率，%18.22 25.99 63.30 76.08 85.15 IC50，μg/mL IC50，μg/mL 127.3 PA酶解液抑制率，%49.44 60.79 65.04 82.59 91.71 TR酶解液抑制率，%19.40 48.15 41.96 55.02 78.11 PE酶解液抑制率，%6.39 35.32 43.87 55.44 75.39 133.4

表4 不同酶解液的95%%乙醇洗脫部位作用48 h時對HSC-T6細(xì)胞的影響（±s，n＝5）Tab 4 Effects of 95%%ethanol elution parts from different hydrolyzates on HSC-T6 cells at 48 h（±s，n＝5）

表4 不同酶解液的95%%乙醇洗脫部位作用48 h時對HSC-T6細(xì)胞的影響（±s，n＝5）Tab 4 Effects of 95%%ethanol elution parts from different hydrolyzates on HSC-T6 cells at 48 h（±s，n＝5）

劑量，μg/mL 110 120 130 140 150劑量，μg/mL 110 120 130 140 150劑量，μg/mL 110 120 130 140 150 IC50，μg/mL IC50，μg/mL 120.0112.0對照反應(yīng)液抑制率，%35.42 47.52 64.92 80.90 90.96 NE酶解液抑制率，%35.52 48.13 69.07 76.17 84.70 AL酶解液抑制率，%23.81 44.77 57.82 76.19 90.82 IC50，μg/mL IC50，μg/mL 119.8122.9 IC50，μg/mL IC50，μg/mL 124.1 PA酶解液抑制率，%45.96 66.21 70.77 90.55 86.74 TR酶解液抑制率，%39.00 44.19 54.10 66.32 89.23 PE酶解液抑制率，%17.16 21.63 32.02 53.60 70.94 136.8

表5 不同酶解液的95%%乙醇洗脫部位作用72 h時對HSC-T6細(xì)胞的影響（±s，n＝5）Tab 5 Effects of 95%%ethanol elution parts from different hydrolyzates on HSC-T6 cells at 72 h（±s，n＝5）

表5 不同酶解液的95%%乙醇洗脫部位作用72 h時對HSC-T6細(xì)胞的影響（±s，n＝5）Tab 5 Effects of 95%%ethanol elution parts from different hydrolyzates on HSC-T6 cells at 72 h（±s，n＝5）

劑量，μg/mL 110 120 130 140 150劑量，μg/mL 110 120 130 140 150劑量，μg/mL 110 120 130 140 150 IC50，μg/mL IC50，μg/mL 116.194.5對照反應(yīng)液抑制率，%36.04 65.24 71.19 83.73 99.85 NE酶解液抑制率，%42.78 46.20 78.48 97.41 97.21 AL酶解液抑制率，%33.52 57.88 76.69 80.19 96.35 IC50，μg/mL IC50，μg/mL 117.1122.8 IC50，μg/mL IC50，μg/mL 117.6 PA酶解液抑制率，%67.21 78.07 82.15 90.27 102.06 TR酶解液抑制率，%20.80 54.99 69.32 68.44 96.43 PE酶解液抑制率，%13.66 23.41 40.27 86.44 98.05 128.3

3 討論

酶解法輔助提取中藥材中的活性成分是一種新興的高效提取方法，是目前制備生物活性多肽的常用方法之一，可在不降低多肽活性的同時提高其得率[13，16]。王濤等[24]采用堿法、鹽法和酶法對美洲大蠊蛋白質(zhì)進行分離和提取，通過小鼠傷口愈合實驗篩選出最優(yōu)方法為胰蛋白酶提取法。羅廷順等[22]研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊醇提取物經(jīng)PA酶解后分子量變小、分布變寬。但至今尚未見通過酶解工藝制備美洲大蠊脫脂膏中抗肝纖維化活性部位的研究報道。本研究分別采用TR、PE、AL、PA、NE這5種常用蛋白酶，對美洲大蠊脫脂膏進行酶解處理。TR主要來源于胰臟，作用于精氨酸、賴氨酸殘基側(cè)的肽鍵[25]；PE主要來源于胃黏膜，主要作用于疏水性氨基酸（如苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、色氨酸）[18]；AL的主要酶切位點為丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸[18]；PA屬于巰基蛋白酶，可水解絕大多數(shù)肽鍵，但對不同肽鍵水解的速率相差較大，該酶對蛋白質(zhì)或多肽中精氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸的羧基形成的肽鍵非常敏感[26]；NE作用底物廣泛，反應(yīng)條件溫和[27]。

本研究首先采用茚三酮法和福林酚法測得不同蛋白酶對美洲大蠊脫脂膏的水解度，其大小排序依次為NE＞PA＞AL＞TR＞PE。其次，采用大孔樹脂法分離純化美洲大蠊酶解液，結(jié)果顯示，不同酶解液的95%乙醇洗脫部位得率大小排序依次為PA＞NE＞AL＞PE＞TR，其中PA、NE、AL酶解液的95%洗脫部位得率較對照反應(yīng)液分別提高了30.36%、16.07%、14.29%。再次，考察了不同酶解液的50%、60%、70%、95%乙醇洗脫部位對HSC-T6細(xì)胞的體外增殖抑制作用。肝星狀細(xì)胞（HSC）是肝纖維化時產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的主要細(xì)胞，已有研究表明，HSC活化為肌成纖維細(xì)胞并大量分泌ECM的過程是肝纖維化病理機制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[28]。因此，抑制HSC的活化和增殖能夠抑制肝纖維化的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，50%、60%、70%乙醇洗脫部位的體外抗肝纖維化作用較對照反應(yīng)液洗脫物均未明顯提高，個別洗脫部位甚至對HSC-T6細(xì)胞表現(xiàn)出促進生長的作用；而95%乙醇洗脫部位對HSC-T6細(xì)胞則表現(xiàn)出較好的體外抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊脫脂膏水解蛋白酶的水解度與其獲得的抗肝纖維化活性部位的得率及對HSC-T6細(xì)胞的體外抑制活性之間存在一定關(guān)聯(lián)：PA、NE、AL對美洲大蠊脫脂膏的水解度較高，同時其純化所得95%乙醇洗脫部位的得率也較高，對HSC-T6細(xì)胞抑制活性的IC50值也較??；PE幾乎無水解作用，其純化所得洗脫部位的得率相對較低，抑制活性的IC50值也較大。但上述3個評價指標(biāo)之間并非呈絕對正相關(guān)，分析其原因可能是美洲大蠊中具有抗肝纖維化作用的并非單一化合物，而是多成分間協(xié)同作用的結(jié)果，并且可能存在一定的配比關(guān)系。因此，對美洲大蠊脫脂膏酶解效果的評價不能僅依據(jù)水解度，還需結(jié)合其純化提取物的得率和活性進行綜合評價。

綜上，本研究確定PA作為美洲大蠊脫脂膏的酶解工藝的最佳水解酶，NE、AL效果次之但亦具有一定研究價值，PE、TR效果較差，不適用于該酶解工藝。本研究為酶解工藝的后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)，后期擬對PA酶解美洲大蠊脫脂膏制備抗肝纖維化活性部位的工藝進行優(yōu)化。