5-羥色胺2A受體基因多態(tài)性與肺癌患者疼痛發(fā)生及阿片類藥物需求量的相關性研究Δ

劉貝，華敏，劉堯，孫媛媛，申文#（.徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院疼痛科，江蘇徐州22004；2.徐州醫(yī)科大學江蘇省麻醉與疼痛應用技術(shù)重點實驗室，江蘇徐州 22002）

全球每年癌癥新發(fā)患者眾多，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，預計到2020年，癌癥新發(fā)病例將超過1 500萬人[1]。疼痛是癌癥患者常見的臨床癥狀，晚期癌癥患者的疼痛發(fā)生率可高達70%～90%[2]。盡管臨床針對癌痛的治療方法很多，但大部分患者難以獲得滿意的鎮(zhèn)痛效果。有研究指出，不同個體的疼痛敏感性和藥物鎮(zhèn)痛效果有所差異，而上述差異可能與環(huán)境因素及患者的遺傳特征有關[3]。5-羥色胺（5-HT）是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，當其被相應受體介導后，便可參與痛覺等生理活動的調(diào)節(jié)[4]。5-羥色胺2A受體（5-HT2AR）編碼基因（5-HT2AR）定位于人染色體13q14～21，包括3個外顯子和2個內(nèi)含子，長約 20 kb[5]。其中，rs6313（102C/T）位于第1外顯子，該位點突變雖不引起編碼氨基酸的改變，但可能與患者疼痛個體差異和阿片類藥物需求量有關[6-7]。Polesskaya OO等[8]研究發(fā)現(xiàn)，正常人顳葉皮質(zhì)5-HT2AR基因rs6313位點C等位基因mRNA及編碼蛋白的表達量均低于T等位基因，這可能是導致患者個體疼痛敏感性及阿片類藥物需求量差異的主要原因。為此，本研究擬分析5-HT2AR基因rs6313位點多態(tài)性與肺癌患者疼痛發(fā)生的相關性，并進一步探討其對患者阿片類藥物需求量的影響，以期為實現(xiàn)肺癌患者個體化基因靶向鎮(zhèn)痛治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 納入與排除患者

1.1.1 肺癌患者 納入標準：（1）經(jīng)病理學和/或細胞學診斷為肺惡性腫瘤（不限定腫瘤分期及分型）；（2）年齡為18～80歲，性別不限；（3）神志清楚，不存在交流障礙；（4）漢族（不限定區(qū)域）。排除標準：（1）曾患有或現(xiàn)患有嚴重精神疾病或神志不清者；（2）患有嚴重心、腦血管等中樞系統(tǒng)疾病者；（3）伴有中、重度肝腎功能損傷者；（4）不能進行自我評估者；（5）合并其他慢性疼痛者；（6）研究過程中自行退出和病情突然惡化者。

1.1.2 健康者 納入標準：（1）在徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院體檢中心進行體檢的健康者；（2）簽署知情同意書；（3）年齡為18～80歲，性別不限；（4）漢族（不限定區(qū)域）。排除研究過程中自行退出或拒絕配合者。

1.2 研究對象

本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（倫理批件號：XYFY2015-KL002-01），所有受試者或其家屬均已知情并簽署了知情同意書。選取2017年12月－2018年6月在徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院就診的經(jīng)病理學和/或細胞學診斷為肺惡性腫瘤的患者，作為肺癌組（332例，非連續(xù)入組）；據(jù)其是否伴有疼痛分為疼痛組（177例，男性120例、女性57例）和無痛組（155例，男性102例、女性53例）。另選取同一時期于該院進行體檢的健康者，作為對照組（116例，男性72例、女性44例）。各組受試者均無血緣關系。

1.3 樣本采集與疼痛評估

于入院當日記錄所有受試者的一般資料，包括性別、年齡、身高、體質(zhì)量、病理類型、TNM分期等。采用視覺模擬評分法（VAS）評估肺癌疼痛組患者的疼痛程度，首次評分記為其用藥前VAS評分。VAS評分標準：0分為無痛，1～3分為輕度疼痛，4～6分為中度疼痛，7～10分為重度疼痛[9]。

1.4 疼痛治療

肺癌疼痛組患者的藥物治療及方案調(diào)整均嚴格遵循《歐洲癌痛阿片類藥物鎮(zhèn)痛指南》[10]，并以治療后VAS評分≤3分為“鎮(zhèn)痛效果滿意”[11]。記錄患者鎮(zhèn)痛效果滿意時的阿片類藥物日均需求量，按“曲馬多（口服制劑）200 mg/d＝羥考酮（口服制劑）30 mg/d＝芬太尼（透皮貼劑）25 μg/d＝嗎啡（靜脈注射/皮下注射制劑）20mg/d＝嗎啡（口服制劑）60 mg/d”的標準[10]換算為每日等效嗎啡口服劑量（MEDD）。

1.5 基因型檢測

采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態(tài)性方法（PCR-RFLP）對所有受試者的基因型進行檢測。

1.5.1 DNA提取 抽取所有受試者外周靜脈血2 mL，于－80℃冰箱保存，備用。取上述血樣500 μL，采用樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）提取患者DNA，使用NanoDrop 2000型紫外分光光度計[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]檢測其DNA濃度和純度。

1.5.2 引物設計與合成 PCR引物的設計與合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。上游引物：5′-TCTGCTACAAGTTCTGGCTT-3′，下 游 引 物 ：5′-CTGCAGCTTTTTCTCTAGGG-3′。

1.5.3 PCR擴增 采用TProfessional Standard型高性能梯度PCR儀（德國Whatman Biometra公司）進行擴增。PCR反應體系（共25 μL）：DNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，無核酶水8.5 μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.5.4 酶切 將PCR擴增產(chǎn)物采用限制性核酸內(nèi)切酶MspⅠ[12]進行酶切，酶切反應體系（共31 μL）：PCR產(chǎn)物10 μL、10×Buffer Tango 2 μL、MspⅠ酶1 μL、焦碳酸二乙酯（DEPC）水18 μL，于37 ℃的SHP-080型高階恒溫箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]中酶切3～6 h。其中，T等位基因不能被限制性核酸內(nèi)切酶切斷，片段大小為342 bp；C等位基因可被限制性核酸內(nèi)切酶切斷，片段大小為126、216 bp；各基因型酶切產(chǎn)物片段大小——野生型純合子（CC）：126、216 bp，突變型雜合子（CT）：126、216、342 bp，突變型純合子（TT）：342 bp[13]。酶切完成后，將各酶切產(chǎn)物置于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳（電壓：120 V，時間：45 min），使用ChemiDoc XRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）拍照。

1.5.5 驗證 隨機抽取不同基因型的PCR產(chǎn)物采用Sanger測序法進行驗證，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0和Graphpad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用Kolmogorov-Smirnov法進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)及率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用χ2檢驗分析受試者基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡；采用Hosmer-Lemeshaw檢驗評價模型擬合度，采用二元Logistic回歸分析對肺癌疼痛發(fā)生的影響因素進行評價。檢驗水準α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

3組受試者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，詳見表1。

表1 3組受試者一般資料比較Tab 1 Comparison of general data of subjects among 3 groups

2.2 基因型與等位基因頻率分布

本研究共檢出5-HT2AR基因rs6313位點CC、CT、TT等3種基因型，各基因型酶切產(chǎn)物片段大小分別為126、216 bp（CC型），126、216、342 bp（CT型），342 bp（TT型），詳見圖1。經(jīng)驗證，Sanger測序結(jié)果與PCR-RFLP方法基因型鑒定結(jié)果一致，詳見圖2。

圖1 rs6313位點酶切產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig 1 Gel electrophoresis of rs6313 locus enzyme products

各組受試者5-HT2AR基因rs6313位點CC、CT、TT型和T、C等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），表明本研究納入的對象可代表整個群體的分布情況。同時，肺癌組患者5-HT2AR基因rs6313位點CC、CT、TT型和T、C等位基因頻率與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表2。

2.3 肺癌患者疼痛發(fā)生相關因素分析

以肺癌患者是否疼痛為應變量，患者性別、年齡、身高、體質(zhì)量、病理類型、TNM分期、rs6313基因型等因素為自變量進行二元Logistic回歸分析，各自變量賦值——性別：男＝0，女＝1；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ＝0，Ⅲ～Ⅳ＝1；基因型：CC＝1，CT＝2，TT＝3；病理類型：鱗癌＝1，腺癌＝2，小細胞癌＝3，其他＝4。分析結(jié)果顯示，模型擬合度良好（Hosmer-Lemeshaw 檢驗：χ2＝13.811，P＝0.087＞0.05）。其中，TNM分期（Ⅲ～Ⅳ期）對肺癌患者疼痛發(fā)生有影響[比值比（OR）＝3.661，95%置信區(qū)間（CI）（1.972，6.797），P＜0.001]，是肺癌疼痛發(fā)生的危險因素，而rs6313位點基因型及性別、年齡等其他因素與肺癌患者疼痛的發(fā)生無關（P＞0.05），詳見表3[表中，（1）、（2）、（3）等表示啞變量，啞變量個數(shù)＝自變量水平數(shù)減1]。

圖2 rs6313位點基因型測序圖（Sanger測序法）Fig 2 Genotype sequencing diagram of rs6313 locus（Sanger sequencing）

表2 各組受試者rs6313位點基因型及等位基因分布[例（%%）]Tab 2 Distributions of genotype and allele of rs6313locus in subjects of each group[cases（%%）]

表3 肺癌患者疼痛發(fā)生相關因素的二元Logistic回歸分析Tab 3 Binary Logistic regression analysis of pain-related factors in patients with lung cancer

2.4 基因型與肺癌疼痛組患者疼痛程度的相關性

根據(jù)用藥前VAS評分將肺癌疼痛組患者分為輕度疼痛、中度疼痛和重度疼痛組等3個亞組，對其臨床特征和基因型與疼痛程度的相關性進行分析。結(jié)果，3個亞組患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、病理類型、TNM分期等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。3個亞組患者各基因型頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表4。

表4 不同疼痛程度患者rs6313位點基因型分布比較[例（%%）]Tab 4 Comparison of rs6313 locus genotype in patients with different pain levels[cases（%%）]

2.5 基因型與肺癌疼痛組患者阿片類藥物需求量的相關性

Kruskal-Wallis檢驗結(jié)果顯示，3個亞組不同基因型患者MEDD比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），詳見表5。

表5 不同基因型肺癌疼痛患者MEDD比較[M（P25，P75）]Tab 5 Comparison of MEDD among lung cancer pain patients with different genotypes[M（P25，P75）]

3 討論

疼痛嚴重影響惡性腫瘤患者的生存質(zhì)量[14]。基因組學的相關研究發(fā)現(xiàn)，基因的遺傳學變異可以有助于預測和指導癌癥患者的疼痛反應及個體化鎮(zhèn)痛治療[15]。隨著對疼痛遺傳學研究的不斷深入，學者發(fā)現(xiàn)與疼痛有關的多態(tài)性位點主要是通過造成神經(jīng)系統(tǒng)電活動異常、神經(jīng)肽及神經(jīng)遞質(zhì)釋放的改變以及藥物代謝酶與藥物轉(zhuǎn)運體功能異常等途徑來參與疼痛調(diào)節(jié)[16]。研究表明，基因編碼區(qū)多態(tài)性雖不導致氨基酸的改變，但仍可通過改變mRNA的穩(wěn)定性、剪接或定位來影響基因的整體功能[17]。因此，如何解釋這些靜息型多態(tài)性對個體疼痛差異的影響也是未來疼痛遺傳學研究關注的熱點之一。

5-HT2AR是與磷脂酶相關的G蛋白偶聯(lián)受體，是由1 413個核苷酸開放閱讀框架編碼的471個氨基酸組成，其本質(zhì)是糖蛋白。目前發(fā)現(xiàn)的5-HT2AR基因有6種多態(tài)性，其中rs6313為靜息型，突變率為60%，是該基因多態(tài)性位點中突變率最高的一種[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，與其他基因型患者比較，TT型患者對疼痛的敏感性更高；其機制可能是TT型可表達更高水平的mRNA及編碼蛋白，可激活更多的5-HT2AR，而活化后的5-HT2AR可進一步激活磷脂酶C，并將其降解為三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG），以促進更多的鈣離子（Ca2+）流入細胞內(nèi)，提高細胞的興奮性，加快疼痛信號的傳遞[6，19]。此外Ozdemir E等[20]研究發(fā)現(xiàn)，5-HT2AR拮抗劑可抑制嗎啡耐受現(xiàn)象的發(fā)生，并可提高嗎啡等阿片類藥物的鎮(zhèn)痛效果，但這種作用的確切生理機制尚未完全闡明。為此，本研究初步探討5-HT2AR基因rs6313位點多態(tài)性與疼痛發(fā)生及阿片類藥物需求量的相關性。

本研究選取了發(fā)病率和病死率均較高的肺癌，以減少腫瘤類型對個體疼痛差異的影響；以MEDD作為考察指標，以保證使用不同鎮(zhèn)痛方案患者間的可比性[21]；同時，本研究采用經(jīng)典的PCR-RFLP技術(shù)，并借助Sanger測序法予以驗證，以確保分型檢測結(jié)果更為可靠。本研究結(jié)果顯示，各組受試者5-HT2AR基因rs6313位點CC、CT、TT型頻率分別為20.7%、47.4%、31.9%（對照組），20.6%、50.3%、29.0%（無痛組），16.4%、50.8%、32.8%（疼痛組），C、T等位基因頻率分別為44.4%、55.6%（對照組），45.8%、54.2%（無痛組），41.8%、58.2%（疼痛組），與Aoki J等[6]的研究結(jié)果基本一致。肺癌組與對照組受試者基因型頻率和等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學意義。這提示該基因位點多態(tài)性在肺癌患者及健康人群中的分布并無明顯差異。

一項多中心觀察性研究發(fā)現(xiàn)，患者肺癌疼痛的發(fā)生可能與其疾病發(fā)展程度等臨床特征相關[22]，故本研究對與之可能相關的因素（如性別、年齡、病理類型、TNM分期及基因型等）進行了二元Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，患者的性別、年齡、身高、體質(zhì)量、病理類型、rs6313位點基因型等因素均與肺癌患者疼痛的發(fā)生無關；而TNM分期是肺癌患者疼痛發(fā)生的獨立危險因素，與上述研究[22]結(jié)果基本一致。本研究并未發(fā)現(xiàn)5-HT2AR基因rs6313位點多態(tài)性與肺癌患者疼痛發(fā)生的相關性，筆者認為這可能與該位點多態(tài)性增加了外周5-HT2AR的含量、降低了中樞5-HT2AR的含量以及下調(diào)受體敏感性有關，但其分子機制仍有待進一步確證。此外，本研究考察了患者基因型與其疼痛程度的相關性，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)5-HT2AR基因rs6313位點多態(tài)性與患者癌痛程度相關。Aoki J等[6]發(fā)現(xiàn)，5-HT2AR基因rs6313位點多態(tài)性與個體疼痛差異顯著相關；Pata C等[23]比較不同rs6313基因型腸易激綜合征（IBS）患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，TT型患者疼痛閾值較其他基因型患者更低；Gürsoy S等[7]比較發(fā)現(xiàn)，TT型纖維肌痛患者的VAS評分較其他基因型患者更高，TT型患者的個體疼痛閾值低于CT和CC基因型；然而，Tander B等[24]發(fā)現(xiàn)，5-HT2AR基因rs6313位點多態(tài)性與纖維肌痛無關，并不會影響患者疼痛感知。由此可見，該位點多態(tài)性與疼痛程度的相關性研究結(jié)論尚不一致，這可能與受試人群種族及疾病類型差異有關。Aoki J等[6]指出，與5-HT2AR基因rs6313位點CT、CC型攜帶者比較，TT型攜帶者對芬太尼、嗎啡等阿片類藥物的需求量更大。但本研究并未發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性與肺癌疼痛患者阿片類藥物MEDD的相關性，這可能與本研究納入的樣本量有限有關；此外，由于疼痛基因遺傳學作用機制復雜，不排除多種因素（如不同地域、基因相互作用等）的共同作用[25]，故本研究結(jié)果尚有待進一步確證。

綜上所述，5-HT2AR基因rs6313位點多態(tài)性與肺癌患者疼痛的發(fā)生及阿片類藥物的需求量無關，其多態(tài)性可能不是導致肺癌患者疼痛個體差異的主要原因。但本研究為單中心研究，僅初步探討了對5-HT2AR功能有影響的單個基因多態(tài)性，且樣本量不大，同時并未考慮該基因的其他位點或其他疼痛相關基因遺傳變異的影響，故本課題組下一步將研究基因之間的交互作用，聯(lián)合多個基因進行篩選，并結(jié)合疾病狀態(tài)從相關基因mRNA及蛋白質(zhì)表達水平進一步深入探討。