Box-Behnken響應面法優(yōu)化管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的提取工藝研究Δ

孔征，毛樂靜，霍仕霞，蘇婭，姜萌，閆明#（.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊8300；.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049）

管花肉蓯蓉為列當科植物管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa（Schenk）R.Wight]的干燥帶鱗葉的肉質莖，性溫、味甘咸，為補腎壯陽、潤腸通便之要藥，是中亞地區(qū)及新疆特有的藥用植物，主要分布于南疆塔克拉瑪干沙漠邊緣地區(qū)[1]。管花肉蓯蓉收載于2015年版《中國藥典》（一部）[2]，其主要功能成分為苯乙醇苷類化合物[3]。近年來研究發(fā)現，管花肉蓯蓉中的苯乙醇苷類化合物在神經保護[4]和延緩神經退行性疾病[4-5]方面具有良好的開發(fā)前景，現已成為研究的熱點之一。毛蕊花糖苷為苯乙醇苷類化合物中的活性成分之一，本課題組前期藥效評價實驗結果表明，毛蕊花糖苷對神經細胞具有保護作用[4]、對東莨菪堿所致小鼠學習記憶獲得性障礙具有改善作用[5]、對D-半乳糖致衰老模型小鼠的氧化損傷具有抑制作用[6]。毛蕊花糖苷在管花肉蓯蓉中的含量約為0.05～8%[7]，對其進行開發(fā)利用具有很大的藥用前景。藥效學實驗表明，毛蕊花糖苷具有多靶點作用，有望開發(fā)成保護腦神經、改善記憶的腦病藥物[8-9]。

Box-Behnken響應面設計法是可靠的實驗設計以及分析方法，可通過對過程的回歸擬合和響應曲面、等高線的繪制來計算出響應于各因素水平的響應值，是解決多變量問題的一種有效的統(tǒng)計方法[10]。鑒于此，本研究采用該法優(yōu)化管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的提取工藝，為管花肉蓯蓉的深入開發(fā)和綜合利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀，包括LC-20AB型二元泵、SPD-M20A型二極管陣列檢測器、CBM-20A型系統(tǒng)控制器、CTO-20A型柱溫箱、SIL-20A型自動進樣器（日本Shimadzu公司）；SQP-QUINTIX 35-1 CN型萬分之一分析天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；DZTW型恒溫電熱套（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

管花肉蓯蓉炮制片（新疆維吾爾自治區(qū)和田蓯蓉堂2015年秋收炮制片，批號：20150806，毛蕊花糖苷含量：≥3.79%；將管花肉蓯蓉炮制片用藥錘敲碎，粉碎機粉碎后過四號篩，即得管花肉蓯蓉粉末，備用）；毛蕊花糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111530-201208，純度：92.5%）；甲醇為色譜純，甲酸、乙醇等為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 毛蕊花糖苷的含量測定

采用高效液相色譜法（HPLC）測定。

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3V（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.2%甲酸水溶液（40∶60，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：330 nm；進樣量 10 μL。在上述色譜條件下，取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”項下溶液進樣測定，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 對照品溶液的制備 取毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，得每1 mL含毛蕊花糖苷0.932 4 mg的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 準確稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，按液料比8∶1（溶劑體積∶粉末質量，mL/g，下同）加入63%乙醇，浸泡2 h，然后置于100℃恒溫水浴鍋中回流提取2次，每次1.5 h，趁熱濾過，放冷，合并提取液，精密量取提取液1 mL至25 mL量瓶中，加50%甲醇定容，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備 分別以50%甲醇與63%乙醇作為陰性對照溶液。

2.1.5 方法學考察 精密量取“2.1.2”項下對照品溶液0.2、0.5、1、2、3、5、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.1.1”項下色譜條件測定。以對照品溶液質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y＝19 952x－218 412（r＝0.999 8），表明毛蕊花糖苷檢測質量濃度的線性范圍為18.65～932.4 μg/mL。以信噪比10∶1、3∶1測得定量限、檢測限分別為0.229 6、0.071 8μg/mL。方法學考察結果顯示，精密度[毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.57%（n＝6）]、穩(wěn)定性[毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.38%（n＝6）]、重復性[毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.87%（n＝6）]、加樣回收率[毛蕊花糖苷低、中、高質量濃度的平均加樣回收率依次為99.6%、100.5%、100.7%，RSD分別為2.55%、0.83%、0.44%（n＝9）]均符合2015年版《中國藥典》（四部）要求[11]。

2.2 提取方法

準確稱取管花肉蓯蓉粉末，按一定液料比加入適宜濃度的乙醇，浸泡一定時間后，置于100℃恒溫水浴鍋中回流提取數次，趁熱濾過，放冷，合并提取液，精密移取提取液1 mL至25 mL量瓶中，以50%甲醇定容后，取樣10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，按標準曲線法計算毛蕊花糖苷含量。另取管花肉蓯蓉粉末，采用2015年版《中國藥典》（一部）項下方法[2]進行含量測定，并通過以下公式計算毛蕊花糖苷提取率[12]：提取率（%）＝{[提取液體積（mL）×提取液含量（mg/mL）]/[藥材質量（g）×藥材含量（mg/g）]}×100%。

2.3 單因素試驗

在管花肉蓯蓉苯乙醇苷類成分乙醇回流提取的過程中，浸泡時間、乙醇濃度、提取時間、液料比、提取次數等因素對提取效果有重要影響[13-14]。因此本研究以毛蕊花糖苷提取率為考察指標，對上述因素進行考察。

2.3.1 浸泡時間 稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，共5份，固定提取時間為1 h、液料比為10∶1、溶劑濃度為60%、提取次數為1次，分別對浸泡時間0、2、8、12、24 h進行考察，結果見圖2A。由圖2A可見，當浸泡時間≥2 h，毛蕊花糖苷的提取率基本趨于穩(wěn)定，綜合考慮提取效率，最終確定最佳浸泡時間為2 h。

2.3.2 乙醇濃度 稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，共4份，固定提取時間為1 h、液料比為10∶1、浸泡時間為2 h、提取次數為1次，分別對提取溶劑水、40%乙醇、60%乙醇和80%乙醇進行考察，結果見圖2B。由圖2B可見，當乙醇濃度為60%時，毛蕊花糖苷的提取效果最好；提高乙醇濃度至80%時，毛蕊花糖苷的提取效率反而下降，故選擇乙醇濃度50%～70%進行后續(xù)試驗。

2.3.3 提取時間 稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，共4份，固定液料比為10∶1、乙醇濃度為60%、浸泡時間為2 h、提取次數為1次，分別對提取時間1、1.5、2、2.5 h進行考察，結果見圖2C。由圖2C可見，隨著提取時間延長，毛蕊花糖苷提取率先增大后減小，于1.5 h達到峰值，故選擇提取時間1～2 h進行后續(xù)試驗。

2.3.4 液料比 稱取管花肉蓯蓉粉末，100 g，共4份，固定提取時間為1.5 h、乙醇濃度為60%、浸泡時間為2 h、提取次數為1次，分別對液料比6∶1、8∶1、10∶1、12∶1進行考察，結果見圖2D。由圖2D可見，當液料比為8∶1時，毛蕊花糖苷的提取率最高；隨著液料比增加，毛蕊花糖苷提取率先增大后減小，故選擇液料比6∶1～10∶1進行后續(xù)試驗。

圖2 單因素試驗結果Fig 2 Results of single factor tests

2.3.5 提取次數 稱取管花肉蓯蓉粉末100 g，共4份，固定液料比為8∶1、乙醇濃度為60%、浸泡時間為2 h、提取時間為1.5 h，分別對提取次數1、2、3、4次進行考察，結果見圖2E。由圖2E可見，提取2次后毛蕊花糖苷的提取率為73.57%，提取第3次與第4次時毛蕊花糖苷提取率基本不變，考慮工藝的成本，最終確定最佳提取次數為2次。

由上述單因素試驗結果可知，浸泡2 h以后，延長浸泡時間所得毛蕊花糖苷的提取率基本保持不變；提取2次以后，增加提取次數所得提取率亦基本保持不變。故從節(jié)約能源與縮短試驗周期的角度考慮，未將浸泡時間與提取次數作為后續(xù)優(yōu)化因素。

2.4 Box-Behnken響應面試驗

2.4.1 Box-Behnken試驗設計 在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）為考察因素，采用3因素3水平的響應面法進行試驗。因素與水平見表1，試驗設計與結果見表2。

表1 因素與水平Tab 1 Factors and levels

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Tab 2 Box-Behnken experiment design and results

2.4.2 模型建立與方差分析 通過Design-Expert 8.0.5軟件對上述試驗結果進行多元二次回歸擬合，得到回歸方程：毛蕊花糖苷提取率（Y）＝75.86+5.38A+1.38B－0.58C+0.18AB+0.57AC+0.57BC－9.00A2－5.26B2－2.50C2（r＝0.993 3）。r＞0.09提示該模型擬合度較好，預測性較好[15]。對該模型進行方差分析，結果見表3。

根據表3中F的大小，推測影響本試驗提取率大小的影響因素為乙醇濃度＞液料比＞提取次數，所建模型經檢驗具有顯著性（P＜0.000 1），說明模型與實際情況吻合良好；模型失擬項檢驗不具有顯著性（P＝0.671 5＞0.05），說明未知因素對模型擬合結果的干擾少，模型誤差較??；可用該模型較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。因此，可用該模型預測毛蕊花糖苷的提取工藝條件。

2.4.3 響應面圖與等高線圖分析 分別以乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時間（C）為響應因子，以毛蕊花糖苷提取率為響應值，使用Design-Expert 8.0.5軟件繪制響應面和等高線圖，詳見圖3。

表3 擬合回歸分析結果Tab 3 Fitting regression analysis results

圖3 各因素對毛蕊花糖苷提取率影響的響應面圖和等高線圖Fig 3 Response surface plots and contour plots for the effect of each factor on the extraction rate of verbascoside

乙醇濃度和液料比的交互作用對毛蕊花糖苷提取率的影響如圖3A、3B所示，固定液料比，乙醇濃度在50%～62.96%范圍內，毛蕊花糖苷的提取率逐漸增高，當乙醇濃度超過62.96%時，毛蕊花糖苷的提取率降低，當固定乙醇濃度時，毛蕊花糖苷的提取率隨著液料比的增加，先增大后減?。粓D3B等高線圖表明，乙醇濃度和液料比之間的交互作用顯著。乙醇濃度和提取時間的交互作用對毛蕊花糖苷的提取率影響如圖3C、3D所示，固定乙醇濃度，提取時間在1～2 h的范圍內毛蕊花糖苷的提取率先升高后下降，提取率最高點對應的提取時間為1.47 h；圖3D等高線圖表明，乙醇濃度和提取時間交互作用顯著。提取時間和液料比的交互作用對毛蕊花糖苷的提取率影響如圖3E、3F所示，固定提取時間，液料比在6∶1～10∶1的范圍內毛蕊花糖苷提取率先增高后下降，提取率最高點對應的液料比為8.26∶1；圖3F等高線圖表明，液料比和提取時間之間的交互作用顯著。

根據以上結果，運用Design-Expert 8.0.5軟件優(yōu)化所得的毛蕊花糖苷提取最佳工藝為乙醇濃度62.96%、液料比8.26∶1、浸泡時間2 h、提取時間1.47 h、提取2次。在此條件下毛蕊花糖苷提取率的預測值為76.76%。考慮到試驗的便捷性、可行性與可操作性，筆者對預測的工藝參數進行微調，選擇工藝參數為乙醇濃度63%、液料比8∶1、浸泡時間2 h、提取時間1.5 h、提取2次。

2.5 驗證試驗

取管花肉蓯蓉粉末100 g，共3份，進行驗證試驗。結果，3次驗證試驗毛蕊花糖苷提取率的RSD為1.20%（n＝3），實測值與預測值的相對誤差分別為1.89%、0.25%、3.36%，表明方程與真實試驗情況擬合較好，優(yōu)化的工藝可靠、可行，詳見表4。

表4 驗證試驗結果Tab 4 Results of validation tests

3 討論

響應面法是通過一系列確定性的試驗，擬合一個響應面來模擬真實極限狀態(tài)的曲面圖，其基本思想是假設一個包括一些未知參量的極限狀態(tài)函數與基本變量之間的解析表達式來代替實際不能明確表達的結構極限狀態(tài)函數[16-20]。而傳統(tǒng)數理統(tǒng)計不能在已有“點”數據基礎上對整體的“面”數據進行預測。因此，傳統(tǒng)數理統(tǒng)計具有一定的局限性[17]。利用響應面設計試驗，根據Box-Behnken的中心組合試驗設計原理來尋求最優(yōu)的考察因素和響應值來避免傳統(tǒng)數理統(tǒng)計存在的問題，最終精確找到最佳點并靈敏地考察各因素間的交互作用[17-22]。

有關管花肉蓯蓉中總苯乙醇苷類化合物的提取工藝報道較多[23-24]，但對于因素的優(yōu)化均采用正交試驗方法進行，因此本文采用Box-Behnken響應面分析法對管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的提取工藝進行研究。本研究選擇浸泡時間、乙醇濃度、液料比、提取時間、提取次數等進行單因素試驗，并從中篩選對提取率影響較明顯的3個因素（即乙醇濃度、液料比、提取時間）及相應水平，運用3因素3水平的響應面分析法進行最佳提取工藝篩選。該方法獲得擬合程度較高的數學模型，交互作用結果表明乙醇濃度、提取時間和液料比對毛蕊花糖苷提取率的影響并非簡單的線性關系。

在乙醇濃度考察中，乙醇濃度至80%時毛蕊花糖苷的提取效率反而下降的原因，筆者認為，一方面，當乙醇濃度達到50%～70%時，藥物在該溶劑中的溶解度最高；另一方面，可能是由于“相似相溶”原理，60%乙醇的極性與毛蕊花糖苷極性相近[25]。在提取時間考察中，隨著提取時間的延長，毛蕊花糖苷提取率反而下降，可能與毛蕊花糖苷發(fā)生降解有關。在提取液料比考察中，毛蕊花糖苷提取率的變化與其向溶劑擴散有關。當液料比低于6∶1時，兩相界面間的濃度差較小，不利于成分擴散；當液料比大于8∶1時，受到已提成分對未提成分協(xié)同浸提作用的影響，提取率反而降低；當液料比大于10∶1時，成分質量濃度下降，不利于協(xié)同浸提，毛蕊花糖苷提取率反而降低[25-26]。最終獲得的最佳工藝參數為乙醇濃度63%、液料比8∶1、提取時間1.5 h，并通過驗證試驗證明了工藝的可行性。本工藝所用乙醇濃度為63%，濃度較低，可節(jié)省生產成本；同時，與其他提取方法[27-28]相比，具有更好的可重復性；此外，回流提取法簡便易行，可作為進一步擴大生產的依據。

綜上所述，本研究優(yōu)化所得管花肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的提取工藝穩(wěn)定、可行，適用于該化合物的提取。