復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片中非法成分土大黃苷定性篩查與定量測(cè)定方法的建立Δ

陳學(xué)艷，張敏娟，魏文芝（1.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院化學(xué)室，西寧810016；2.青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片是由碳酸氫鈉、大黃膏（粉）、龍膽膏（粉）、丁香油、薄荷油和適宜輔料組方而成的復(fù)方制劑，臨床主要用于治療胃脹、反酸、食欲不振等[1]。按照2015年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定，該制劑組方中的大黃藥材應(yīng)來源于蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.）或藥用大黃（Rheum officinale Baill.）[2]，不含土大黃苷成分；而藏邊大黃（Rheum australe D.Don）、華北大黃（Rheum franzenbachii Munt）和波葉大黃（Rheum undulatum L.）等偽品中含有土大黃苷[3-4]。當(dāng)前藥材市場(chǎng)上大黃品種混亂及質(zhì)量不均一的問題較為嚴(yán)峻，尤其在大黃價(jià)格上升時(shí)，存在以廉價(jià)而幾乎無瀉下作用、服用后有腹痛副作用的藏邊大黃、華北大黃等摻假冒充的情況[5-6]。復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》WS-10001（HD-0351）-2002-2011，其中缺乏土大黃苷的檢查項(xiàng)。原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2010年5月5日批準(zhǔn)發(fā)布藥品檢驗(yàn)補(bǔ)充檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)項(xiàng)目，要求對(duì)偽品大黃藥材中的土大黃苷進(jìn)行檢查（批件號(hào)：2010001），但未規(guī)定復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片中非法成分土大黃苷的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，也未見相關(guān)研究報(bào)道。為此，本課題組參考上述補(bǔ)充檢驗(yàn)方法、2015年版《中國(guó)藥典》（一部）“大黃”品種項(xiàng)下的相關(guān)規(guī)定及相關(guān)文獻(xiàn)等，建立了復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片中土大黃苷的檢測(cè)方法，旨在為控制該制劑原藥材的質(zhì)量、確保該藥臨床使用的有效性和安全性提供技術(shù)支持。

1 材料

1.1 儀器

BS224S型萬分之一電子天平、CP225D型十萬分之一電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；e2695-2998型高效液相色譜（HPLC）儀（包括二極管陣列檢測(cè)器、四元泵一體機(jī)）、Acquity UPLC-TQD型液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（包括三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器）均購自美國(guó)Waters公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；TLC Visualizer型薄層數(shù)碼成像儀（瑞士CAMAG公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片（從藥品流通領(lǐng)域抽樣獲取，分別來自編號(hào)為A、B、C、D、E、F、G、H的國(guó)內(nèi)8家藥品生產(chǎn)企業(yè)，樣品信息詳見表1）；土大黃苷對(duì)照品[中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110794-201708，供薄層色譜（TLC）和HPLC檢查用]；聚酰胺薄膜（臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠，供薄層層析用）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

表1 復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片樣品信息Tab 1 Sample information of Compound gentian and sodium bicarbonate tablets

1.3 藥材

大黃藥材（本課題組自購，分別產(chǎn)自青海省大通縣、湟中縣、果洛藏族自治州，樣品批次編號(hào)：S1、S2、S3）經(jīng)青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院中藥室劉亞蓉主任中藥師鑒定為唐古特大黃（R.tanguticum Maxim.ex Balf.）的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC法對(duì)土大黃苷的初步定性篩查

參考文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行檢測(cè)。

2.1.1 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細(xì)，按制劑處方稱取約相當(dāng)于大黃生藥100 mg的粉末，加甲醇10 mL，超聲（功率：500 W，頻率：40 kHz，下同）處理20 min，濾過；取續(xù)濾液1 mL，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

2.1.2 陰性樣品溶液的制備 分別按本品各生產(chǎn)企業(yè)處方，制成缺大黃藥材的陰性樣品，再按“2.1.1”項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。

2.1.3 土大黃苷對(duì)照品溶液的制備 取土大黃苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含10 μg的溶液，即得（臨用新制）。

2.1.4 8家企業(yè)樣品的TLC抽檢及復(fù)檢 抽取8家企業(yè)生產(chǎn)的復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片各20片（A企業(yè)樣品批號(hào)：20170717；B企業(yè)樣品批號(hào)：170602；C企業(yè)樣品批號(hào)：171213；D企業(yè)樣品批號(hào)：20170609；E企業(yè)樣品批號(hào)：20161012；F企業(yè)樣品批號(hào)：20180301；G企業(yè)樣品批號(hào)：20160902；H企業(yè)樣品批號(hào)：20170201），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別吸取上述供試品溶液、“2.1.2”項(xiàng)下陰性樣品溶液和“2.1.3”項(xiàng)下土大黃苷對(duì)照品溶液各5 μL，點(diǎn)樣于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-甲酸乙酯-丙酮-甲醇-甲酸（30∶5∶5∶20∶0.1，V/V/V/V/V）為展開劑，展開；取出晾干，采用薄層數(shù)碼成像儀以紫外燈365nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢視。結(jié)果，土大黃苷對(duì)照品溶液顯1個(gè)亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)；陰性樣品溶液在相應(yīng)的位置處未見類似熒光斑點(diǎn)；供試品溶液（D企業(yè)產(chǎn)品，批號(hào)：20170609）在相應(yīng)的位置處顯相同的亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，其余7家企業(yè)產(chǎn)品的供試品溶液則均未見有類似熒光斑點(diǎn)。由此表明，陰性樣品對(duì)TLC檢測(cè)無干擾；抽檢的8家企業(yè)產(chǎn)復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片樣品中僅D企業(yè)產(chǎn)品中有疑似非法成分土大黃苷檢出。8家生產(chǎn)企業(yè)抽檢樣品中土大黃苷的薄層色譜圖見圖1。

圖1 8家生產(chǎn)企業(yè)抽檢樣品中土大黃苷的薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatogram of rhaponiticin in spotchecking samples from 8 manufacturers

進(jìn)一步對(duì)D企業(yè)生產(chǎn)的復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片進(jìn)行重點(diǎn)篩查，對(duì)該企業(yè)產(chǎn)10個(gè)批次樣品（批號(hào)見表1）同法進(jìn)行TLC檢測(cè)。結(jié)果，各批次樣品的供試品溶液均在與土大黃苷對(duì)照品溶液相應(yīng)的位置處顯相同的亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。由此初步判定，D企業(yè)產(chǎn)樣品中含有非法成分土大黃苷。D企業(yè)樣品中土大黃苷的薄層色譜圖見圖2。

圖2 D企業(yè)產(chǎn)樣品中土大黃苷的薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatogram of rhaponiticin from manufacturer D

2.2 HPLC法對(duì)土大黃苷的定性鑒定和含量測(cè)定

2.2.1色譜條件色譜柱：XSelectCSH C18（250 mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（20∶80，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：328 nm（二極管陣列檢測(cè)器）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取約相當(dāng)于大黃生藥100 mg的粉末，精密加入甲醇25 mL，精密稱定；超聲處理60 min，放冷，再次精密稱定，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，以0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取“2.1.2”項(xiàng)下缺大黃藥材的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 土大黃苷對(duì)照品溶液的制備 精密稱取土大黃苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.221 mg的對(duì)照品貯備液；精密吸取該貯備液5 mL，置于20 mL量瓶中，加甲醇稀釋定容，制成質(zhì)量濃度為55.25 μg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.2.5 大黃藥材溶液的制備 取大黃藥材，粉碎并過4號(hào)篩，精密稱取藥材粉末0.2 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備大黃藥材溶液。

2.2.6 專屬性考察 取D企業(yè)產(chǎn)10個(gè)批次樣品（批號(hào)見表1），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。分別取上述供試品溶液、“2.2.3”項(xiàng)下陰性樣品溶液、“2.2.4”項(xiàng)下土大黃苷對(duì)照品溶液和“2.2.5”項(xiàng)下大黃藥材溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果，10批次樣品均在約11.7 min處出現(xiàn)與土大黃苷對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致的色譜峰，詳見圖3。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

為進(jìn)一步確認(rèn)與土大黃苷對(duì)照品溶液主峰保留時(shí)間一致的供試品溶液圖譜中主峰是否為土大黃苷成分，本課題組采用Empower 3色譜系統(tǒng)工作站對(duì)色譜峰進(jìn)行了二極管陣列掃描紫外光譜提取。結(jié)果，二者的紫外光譜掃描圖相似度為99.9%，且均在219.0、324.6 nm波長(zhǎng)處有較大吸收，由此可判定二者主峰為同一物質(zhì)，即土大黃苷，詳見圖4。

圖4 二極管陣列掃描紫外光譜圖Fig 4 Diode array scanning ultraviolet spectrograms

結(jié)合圖3、圖4可見，供試品色譜圖中呈現(xiàn)與對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的色譜峰，并經(jīng)紫外光譜提取后證實(shí)對(duì)應(yīng)的是同一物質(zhì)土大黃苷，且陰性樣品無干擾，由此表明所建方法專屬性良好。

2.2.7 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下土大黃苷對(duì)照品貯備液適量，以甲醇稀釋制成質(zhì)量濃度分別為0.884、8.84、22.1、44.2、88.4 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以土大黃苷對(duì)照品質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、其峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，回歸方程為y＝36 535.57x－27105.99（r＝0.999 9），表明土大黃苷質(zhì)量濃度在0.884～88.4 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.8 檢測(cè)限與定量限 按“2.2.7”項(xiàng)下方法制備質(zhì)量濃度為0.088 4 μg/mL的土大黃苷對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5～10 μL測(cè)定，以信噪比3∶1測(cè)得土大黃苷進(jìn)樣量檢測(cè)限為0.707 2 ng；同法制備質(zhì)量濃度為0.176 8 μg/mL的土大黃苷對(duì)照品溶液，并同法分別進(jìn)樣15～25 μL測(cè)定，以信噪比10∶1測(cè)得土大黃苷進(jìn)樣量定量限為3.536 ng。

2.2.9 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為55.25 μg/mL的土大黃苷對(duì)照品溶液10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，土大黃苷峰面積RSD為0.20%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.10 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)：20171007），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h 時(shí)，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，土大黃苷峰面積的RSD為0.73%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.11 重復(fù)性試驗(yàn) 取D企業(yè)樣品（批號(hào)：20171007）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。結(jié)果，土大黃苷平均含量為2.860 0 mg/g（RSD＝0.78%，n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.12 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的D企業(yè)樣品（批號(hào)：20171007，土大黃苷含量為2.860 0 mg/g）約0.3 g，平行操作6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入質(zhì)量濃度為0.863 mg/mL的土大黃苷對(duì)照品溶液（按“2.2.4”項(xiàng)下制備方法新制）1 mL，再精密加入甲醇25mL，稱定質(zhì)量；超聲處理60 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，即得。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算土大黃苷含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果，土大黃苷的平均回收率為96.55%（RSD＝0.53%，n＝6），表明本方法準(zhǔn)確度良好，詳見表2。

表2 土大黃苷回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of recovery tests of rhaponiticin

2.2.13 耐用性試驗(yàn) 采用不同品牌液相色譜儀（美國(guó)Waters公司e2695-2998型、日本Shimadzu公司LC-20AT型、美國(guó)Agilent公司1260 Infinity型）、不同品牌及型號(hào)的色譜柱（XSelectCSH C18柱、Waters SunFire C18柱、Thermo BDS Hypersil C18柱）分別進(jìn)行相應(yīng)測(cè)定，主峰與相鄰峰之間的分離度均可達(dá)到1.5以上，理論板數(shù)均大于6 000；連續(xù)測(cè)定結(jié)果RSD均小于2%，表明本方法耐用性良好。

2.2.14 各企業(yè)45批次樣品中土大黃苷的含量測(cè)定 精密稱取D企業(yè)產(chǎn)10批次樣品（批號(hào)見表1）適量，平行操作2份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算含量，結(jié)果見表3。另取其余7家企業(yè)生產(chǎn)的35批次樣品（批號(hào)見表1）適量，平行操作2份，同法配制供試品溶液并測(cè)定，結(jié)果均未檢出土大黃苷峰，色譜圖見圖5。

表3 D企業(yè)產(chǎn)10批次樣品中土大黃苷的含量測(cè)定結(jié)果（n＝2，mg/g）Tab 3 Results of content determination of rhaponiticin in 10 batches of samples from manufacturer D（n＝2，mg/g）

2.3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對(duì)檢測(cè)結(jié)果的確證

圖5 A～C、E～H企業(yè)產(chǎn)35批次樣品高效液相色譜圖（疊加圖）Fig 5 HPLC chromatograms of 35 batches of samples from manufacturers A-C and E-H（overlayed maps）

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.8μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.01 mol/L醋酸銨溶液（B）[8]，梯度洗脫（0～4 min，90%A→70%A；4～9 min，70%A；9～11 min，70%A→90%A）；流速：0.35 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧質(zhì)譜檢測(cè)器，負(fù)離子模式（ESI－）；檢測(cè)方式：選擇離子監(jiān)測(cè)（SIR），二級(jí)質(zhì)譜掃描（Daughter scan）方式；去溶劑氣溫度：330℃；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；錐孔電壓：28 V；碰撞能量：42 eV；離子源溫度：110 ℃[9-10]。

2.3.3 供試品稀釋液的制備 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.4 土大黃苷對(duì)照品稀釋液的制備 取“2.2.4”項(xiàng)下的質(zhì)量濃度為55.25 μg/mL的土大黃苷對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋得0.552 5 μg/mL對(duì)照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.5 陰性溶液的制備 取“2.2.3”項(xiàng)下陰性樣品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.6 大黃藥材稀釋液的制備 取“2.2.5”項(xiàng)下大黃藥材溶液，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.7 樣品測(cè)定 精密吸取“2.3.3～2.3.6”項(xiàng)下各溶液，按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定。采用Masslynx 4.1軟件進(jìn)行分析，記錄一級(jí)質(zhì)譜圖與二級(jí)質(zhì)譜圖。結(jié)果顯示，在土大黃苷對(duì)照品稀釋液中檢測(cè)到其準(zhǔn)分子離子[M-H]－峰質(zhì)荷比（m/z）為419.0；對(duì)m/z 419.0峰進(jìn)行二級(jí)子離子掃描，產(chǎn)生的主要碎片離子m/z分別為257.1、241.2。同時(shí)，在供試品稀釋液中也檢測(cè)到m/z 419.0的準(zhǔn)分子離子峰，對(duì)其進(jìn)行二級(jí)子離子掃描質(zhì)譜分析，同樣產(chǎn)生m/z分別為257.1、241.2的碎片離子峰，與土大黃苷對(duì)照品基本一致，詳見圖6。此外，陰性溶液和大黃藥材稀釋液經(jīng)檢測(cè)均未產(chǎn)生與土大黃苷對(duì)照品一致的準(zhǔn)分子離子（圖略），這進(jìn)一步證實(shí)了正品大黃藥材中不含土大黃苷成分且陰性樣品對(duì)檢測(cè)無干擾。

3 討論

3.1 檢測(cè)方法的選擇

圖6 土大黃苷質(zhì)譜圖Fig 6 MS spectra of rhaponiticin

由于中成藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，若僅采用TLC法檢測(cè)某種成分是否存在，易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。本研究對(duì)復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片中非法成分土大黃苷采用TLC法進(jìn)行定性檢測(cè)，初步篩選出陽性樣品；進(jìn)一步與土大黃苷對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)，通過HPLC法準(zhǔn)確測(cè)定樣品中土大黃苷的含量；最后，采用UPLC-MS/MS法對(duì)檢出的土大黃苷的結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，以驗(yàn)證前述HPLC法用于檢測(cè)制劑中土大黃苷含量的方法是否準(zhǔn)確、可行。

3.2 TLC法條件篩選

本課題組前期考察了不同薄層板的分離效果，結(jié)果采用市售硅膠G板和聚酰胺薄膜均可有效分離供試品中的土大黃苷，但后者用于土大黃苷檢測(cè)的靈敏度更高且分離度更好：同一土大黃苷對(duì)照品溶液在硅膠G板上展開后呈現(xiàn)1個(gè)斑點(diǎn)，而在聚酰胺薄膜上除主斑點(diǎn)外尚可見其他2個(gè)斑點(diǎn)。此外，因土大黃苷對(duì)照品溶液不穩(wěn)定，長(zhǎng)期放置主斑點(diǎn)易分解[11]，故對(duì)照品溶液需臨用新制。中藥制劑成分復(fù)雜，采用TLC法檢測(cè)時(shí)常會(huì)出現(xiàn)多個(gè)斑點(diǎn)，且在日光下、紫外光燈下檢視或通過氨蒸氣熏蒸后均呈現(xiàn)不同結(jié)果。本研究最終選擇在紫外光燈下辨識(shí)度較高、顯亮藍(lán)色熒光斑點(diǎn)的結(jié)果為檢視結(jié)果。

3.3 HPLC法樣品處理方法篩選

在供試品溶液制備時(shí)，本課題組參考文獻(xiàn)[12]方法，分別以甲醇、乙醇、乙酸乙酯為溶劑，考察了加熱回流0.5、1、2 h和超聲提取20、40、60 min等條件。結(jié)果，以甲醇為溶劑時(shí)土大黃苷提取較完全，且?guī)缀鯚o雜質(zhì)干擾；加熱回流1 h與超聲處理1 h均可將樣品中的土大黃苷提取完全?？紤]到操作的簡(jiǎn)便可行，本研究選擇加甲醇超聲處理1 h進(jìn)行提取。

3.4 UPLC-MS/MS法條件篩選

在進(jìn)行UPLC-MS/MS分析時(shí)，由于供試品中成分復(fù)雜，分離效果不佳。本課題組將流動(dòng)相洗脫條件由等度洗脫優(yōu)化為適宜的梯度洗脫條件，結(jié)果可提高各成分間的分離度；同時(shí)，考察了不同的離子化模式、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓及碰撞能量等條件，結(jié)果在ESI－模式下，調(diào)節(jié)較低的錐孔電壓和適宜的碰撞能量，可獲得較佳的質(zhì)譜信號(hào)。

3.5 8家企業(yè)抽樣的45批次樣品檢測(cè)結(jié)果分析

本研究采用HPLC法對(duì)從8家企業(yè)抽樣的45批次復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片樣品中的土大黃苷進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果有10個(gè)批次檢出了土大黃苷，檢出率達(dá)22%。這10批樣品均由D企業(yè)生產(chǎn)，說明該企業(yè)在生產(chǎn)復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片時(shí)投料的大黃藥材存在以偽品替代正品的現(xiàn)象。因此，建立專屬性強(qiáng)、靈敏度高的檢測(cè)方法以控制復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片乃至所有含大黃的中藥制劑中土大黃苷的含量，對(duì)于規(guī)范藥品生產(chǎn)、確保藥品質(zhì)量很有必要。

綜上所述，本研究建立的TLC法定性初篩結(jié)合HPLC法定量測(cè)定復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片中非法成分土大黃苷的方法簡(jiǎn)便、靈敏、可靠，現(xiàn)已申報(bào)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局?jǐn)M作為藥品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法實(shí)施；在實(shí)際檢驗(yàn)中，如有必要可采用UPLC-MS/MS法進(jìn)一步確證結(jié)果。