款冬花配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

許洪波，蔡興航，毛晶晶，楊康，許懷禮（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西咸陽 708；.楊凌科森生物制藥有限責(zé)任公司，西安 700；.西安市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，西安 700）

款冬花配方顆粒是以款冬花飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代制藥技術(shù)提取、濃縮、分離、干燥、制粒、包裝而成的顆粒劑，具有潤肺下氣、止咳化痰之功效，是中醫(yī)臨床常用的藥物之一[1]。目前市售不同廠家的款冬花配方顆粒雖有各自的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但質(zhì)量良莠不齊，且尚無統(tǒng)一的行業(yè)或國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；此外，現(xiàn)行的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)主要從性狀、鑒別、檢查、浸出物等方面對款冬花配方顆粒的質(zhì)量進(jìn)行控制，較少有涉及含量測定的內(nèi)容[2]。因此，建立款冬花配方顆粒簡便可行的定性、定量檢測方法顯得尤為重要?；诖耍狙芯坎捎帽由V法（TLC）對款冬花配方顆粒進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法（HPLC）對該方的特征成分款冬酮進(jìn)行定量分析，旨在為其質(zhì)量控制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括CBM-20A型控制器、LC-20AT型雙泵、SPD-20A型紫外檢測器、CTO-20A型柱溫箱、lab Solutions色譜工作站（日本Shimadzu公司）；HT-2109型電磁爐（廣東美的生活電器制造有限公司）；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本EYELA公司）；Vaco 5型冷凍干燥機(jī)（德國Zirbus公司）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CPA2250型電子天平（德國Sartorius公司）；PTL型電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

款冬花配方顆粒（批號：180401、180402、180403，規(guī)格：10 g/袋）、缺款冬花的陰性樣品（批號：180407，規(guī)格：10 g/袋）均由陜西中醫(yī)藥大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)室自制；款冬酮對照品（批號：111884-201704，純度：99.1%）、款冬花對照藥材（批號：121449-201704）均由中國食品藥品檢定研究院提供；硅膠GF254薄層板（青島海浪硅膠干燥劑有限公司，批號：20160702）；甲醇為色譜醇，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 藥材

款冬花飲片（批號：0180303）購自西安藥材市場（藥材產(chǎn)地為內(nèi)蒙古），經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王薇教授鑒定為菊科植物款冬（Tussilago farfaraL.）的干燥花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1TLC鑒別

取款冬花配方顆粒1 g，研細(xì)，加甲醇10 mL，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz，下同）處理1.5 h，濾過，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取款冬花飲片1 g，加乙醇10 mL，超聲提取1.5 h，濾過，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為飲片樣品溶液。取款冬花對照藥材1 g，按飲片樣品溶液制備方法制成款冬花對照藥材溶液。另取款冬酮對照品5 mg，加乙酸乙酯5 mL，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。取缺款冬花的陰性樣品1 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）通則中“TLC法”[3]操作，吸取上述5種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚（60～90 ℃）-丙酮（10∶1，V/V）為展開劑（溫度為21 ℃，濕度為47%），展開，取出，晾干，再以同一展開劑展開，取出，晾干，置于紫外光燈（254 nm）下檢視，再噴以硫酸-乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)清晰，記錄斑點(diǎn)位置。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾，詳見圖1。

圖1 薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatograms

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo ODS Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（85∶15，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取款冬酮對照品11.20 mg（實(shí)際質(zhì)量為11.10 mg），加流動(dòng)相適量，制成質(zhì)量濃度為27.75 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取款冬花配方顆粒1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理1.5 h，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取缺款冬花的陰性樣品1 g，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液，即得。

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖2。結(jié)果，在上述色譜條件下，理論板數(shù)按款冬酮峰計(jì)不低于5 000，分離度＞1.5，其他成分對測定無干擾。

2.2.6 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液0.5、1、2、4、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為1.39、2.78、5.55、11.10、22.20、27.75 μg/mL的系列線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)溶液，取適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得款冬酮的回歸方程為y＝43 103.13x+33.58（r＝0.999 9）。結(jié)果，款冬酮檢測質(zhì)量濃度線性范圍為1.39～27.75 μg/mL。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.2.7 定量限與檢測限考察 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，倍比稀釋，以信噪比10∶1、3∶1分別測定定量限、檢測限。結(jié)果，款冬酮的定量限為0.153 87 μg/mL，檢測限為0.051 42 μg/mL。

2.2.8 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，款冬酮峰面積的RSD為0.94%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液（批號：180402）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，款冬酮峰面積的RSD為0.86%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取配方顆粒樣品適量（批號：180402），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算樣品中款冬酮的含量。結(jié)果，款冬酮的平均含量為0.003 2%，RSD為1.88%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的配方顆粒樣品（批號：180402）適量，共6份，精密稱定，分別加入一定量的款冬酮對照品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.2.12 耐用性試驗(yàn) 精密稱取配方顆粒樣品（批號：180402）適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，考察不同色譜柱（Thermo ODS Hypersil C18、Agilent TC-C18、Hyperil BDS C18）、流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、柱溫（20、25、30 ℃）對樣品含量測定結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，當(dāng)色譜柱、流速和柱溫發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，本方法耐用性良好。

表2 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 Results of durability tests

2.2.13 樣品含量測定 取3批配方顆粒樣品各適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按回歸方程計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，款冬花除具有止咳祛痰[4-5]、平喘[6]、抗炎[7-10]、抗氧化[11-13]、抗腫瘤[14-15]、止瀉[7]等作

用外，對心血管、血流動(dòng)力學(xué)及血小板活化因子亦具有一定的影響[16]。近年來，配方顆粒等現(xiàn)代中藥用藥形式的出現(xiàn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥湯劑的服用量大、不易攜帶、不易保存等缺陷[17-18]。款冬花配方顆粒保持了款冬花飲片的性味與功效，可直接用于中醫(yī)辨證施治，具有不需煎煮、服用方便、吸收迅速、劑量準(zhǔn)確、安全清潔、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)[19]；但目前尚缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為此，本研究采用TLC法對款冬花配方顆粒進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法測定了款冬花配方顆粒中款冬酮的含量。

本研究采用2015年版《中國藥典》（一部）[20]方法進(jìn)行TLC，但發(fā)現(xiàn)以石油醚-丙酮（6∶1，V/V）為展開劑時(shí)極性偏大，主要斑點(diǎn)靠近展開前沿，因此筆者在參考2015年版《中國藥典》（一部）[20]TLC法的基礎(chǔ)上，將石油醚-丙酮的極性調(diào)?。w積比為10∶1），后發(fā)現(xiàn)款冬花配方顆粒中主要斑點(diǎn)分離度良好，斑點(diǎn)清晰。

在指標(biāo)成分選擇方面，有文獻(xiàn)以蘆丁為指標(biāo)成分[21]，但蘆丁既不是款冬花含量較高的成分，也不是其專屬成分，考慮到款冬酮是款冬花的特征成分，且該成分具有抗炎、升壓等藥理作用[22]。因此，本研究以款冬酮為款冬花配方顆粒的指標(biāo)成分進(jìn)行含量測定。但在研究過程中筆者發(fā)現(xiàn)，款冬酮在款冬花配方顆粒中含量較低。其原因可能為：一方面，款冬酮在款冬花藥材中含量較低，2015年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定，款冬花藥材中款冬酮含量不得少于0.070%[20]；另一方面，因款冬酮為親脂性成分，而款冬花配方顆粒在制備時(shí)以水為提取溶劑，因此導(dǎo)致部分款冬酮未被提取出來，以致其在款冬花配方顆粒中含量較低。筆者認(rèn)為，款冬酮作為款冬花中的特征成分，目前可作為款冬花配方顆粒含量測定的控制項(xiàng)；但同時(shí)因其含量較低，故有必要尋找款冬花中其他含量較高的特征成分以替代款冬酮對其進(jìn)行含量控制。TLC結(jié)果顯示，在款冬花藥材、飲片樣品及款冬花配方顆粒TLC圖譜中，均出現(xiàn)了一個(gè)與款冬酮顯相似顏色的清晰斑點(diǎn)（圖1B中位于款冬酮上方最為清晰的斑點(diǎn)），該斑點(diǎn)是否為款冬酮的類似物，以及是否可作為款冬花配方顆粒含量測定的指標(biāo)性成分仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究方法操作簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于款冬花配方顆粒的質(zhì)量控制。