RanBPM調(diào)控IFN-λR1-STAT5通路分子機(jī)制研究

張俊文 趙喬佳杰 楊 霞 馬 雯 黃秉仁 劉福生

Ⅲ型干擾素(interferon λs，IFN-λs)是重要抗病毒、抗腫瘤細(xì)胞因子[1]。IFN-λs的受體是由白介素10受體2(interleukin 10 receptor 2, IL-10R2)和干擾素λ受體1(IFN receptors, IFN-λR1)組成的異源四聚體[2]，雖然Ⅲ型干擾素與Ⅰ型干擾素結(jié)合的受體不同，但是它們均是通過激活Janus激酶(Janus kinase, Jak)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)來傳遞信號(hào)，因此Ⅲ型干擾素表現(xiàn)出與Ⅰ型干擾素類似的生物活性。典型的Jak-STAT信號(hào)通路依賴于STAT的磷酸化，干擾素結(jié)合其受體后引起Jak以及下游的STAT1和STAT2的磷酸化，與干擾素調(diào)節(jié)蛋白9(interferon regulatory factor 9, IRF9)組成復(fù)合體，形成干擾素刺激因子3(IFN-stimulated gene factor 3, ISGF3)，進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其抗病毒、抗增殖及抗微生物等活性[3, 4]。關(guān)于干擾素λ信號(hào)通路同干擾素α信號(hào)通路比較的區(qū)別，首先IFN-λR1不是普遍表達(dá)的，尤其在免疫細(xì)胞中其表達(dá)有明顯的差別，所以免疫細(xì)胞對(duì)IFN-λ1更加敏感。此外，IFN-λ和IFN-λR結(jié)合親和力與IFN-α的結(jié)合親和力比較差異很大。最后，以單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphisms，SNP)形式出現(xiàn)的遺傳變異與參與IFN-λ信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)，這與乙肝和丙肝病毒感染的臨床進(jìn)程和治療關(guān)系密切[5]。

與Ⅰ型干擾素不同的是，IFN-λs還能誘導(dǎo)除STAT1以外的其他STAT的磷酸化，如STAT3和STAT5[6]。這就意味著IFN-λ信號(hào)途徑比其他的IFN途徑要復(fù)雜的多。前期研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞系中IFN-λ1能夠引起STAT5的磷酸化[7]。由此筆者推測IFN-λ1的受體IFN-λR1可能參與STAT5的相互作用。同時(shí)前期研究中筆者也發(fā)現(xiàn)IFN-λR1能與RAN蛋白在微管組織中心的結(jié)合蛋白(ran binding protein in the microtubule-organizing center, RanBPM又被稱為RanBP9)相互作用，增強(qiáng)了干擾素刺激反應(yīng)原件(IFN-stimulated response elements, ISRE)的活性，調(diào)控干擾素λ途徑[8]。但是，RanBPM是否能與STAT5相互結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控其活性影響干擾素λ途徑尚不清楚。本研究中筆者將以STAT5A為研究對(duì)象，明確RanBPM能否與其相互作用，以及相互作用后對(duì)IFN-λ信號(hào)途徑的影響。

材料與方法

1.材料:人胚腎細(xì)胞株HEK293T、肝癌細(xì)胞株Huh7、Hep3B由本實(shí)驗(yàn)室保存。表達(dá)質(zhì)粒pCMV-Myc、pFlag-CMV2、pFlag-IFN-λR1及其截短體質(zhì)粒，pHA-RanBPM及其截短體質(zhì)粒，pMyc-STAT5A，報(bào)告基因質(zhì)粒pGL3-basic、pSTAT5-luc、pRL-SV40由本實(shí)驗(yàn)室保存或構(gòu)建。胎牛血清、DMEM、PBS、0.05%胰酶、青霉素/鏈霉素和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；重組人干擾素lambda1(rhIFN-λ1)由本實(shí)驗(yàn)室純化；雙熒光素報(bào)告基因試劑購自美國Promega公司；蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司；Protein A/G-瓊脂糖介質(zhì)購自美國GE公司；anti-Flag和anti-HA、抗體購自美國Sigma公司，anti-Myc抗體購自美國Santa Cruz公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：HEK 293T、Huh 7或Hep 3B細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)，在含5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞用含0.05%胰蛋白酶消化、傳代，待細(xì)胞增殖旺盛、狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染和rhIFN-λ1處理細(xì)胞:消化細(xì)胞，將細(xì)胞傳到6孔板或96孔板后，細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右，可以進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前2h，將培養(yǎng)基更換為含3%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，然后按照Lipofectamine 3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6h后將培養(yǎng)基更換含10%胎牛血清的常規(guī)培養(yǎng)基。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h之后，棄掉舊培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗3次。然后再細(xì)胞中加入含3%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置到37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～4h，然后加入rhIFN-λ1(終濃度為200ng/ml)處理相應(yīng)的時(shí)間。

4.細(xì)胞裂解和免疫共沉淀:細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，觀察細(xì)胞狀態(tài)以及細(xì)胞數(shù)量。配置新鮮的細(xì)胞裂解液(含150mmol/L NaCl，50mmol/L Tris-HCl pH值為7.6，1% NP-40，10% glycerol，蛋白酶抑制劑)。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)基，然后用PBS洗細(xì)胞，加入適量的細(xì)胞裂解液。用細(xì)胞刮棒將細(xì)胞刮下，將細(xì)胞放置在冰上15min，然后12000r/min離心10min。取離心上清液，測量蛋白濃度。取1/10裂解液體積作為參照物(input)，用于檢測細(xì)胞裂解液中各個(gè)目的基因的表達(dá)情況。取400μg總蛋白，首先用與免疫共沉淀抗體同屬種的IgG進(jìn)行預(yù)處理1h，然后再加入1μg免疫共沉淀的抗體，放置到4℃混勻儀上過夜。然后加入40μl protein A/G-Sephorose 介質(zhì)，4℃繼續(xù)孵育1h。然后3000r/min離心2min，棄上清，用細(xì)胞裂解液洗滌介質(zhì)，15分/次，洗滌2次；加入上樣緩沖液，混勻后在沸水中使蛋白變性。根據(jù)目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，配置不同濃度的SDS-PAGE分離蛋白，Western blot法檢測目的蛋白的表達(dá)。

表1 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中各組每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒量(μg)

結(jié) 果

1.IFN-λR1中含有兩個(gè)STAT5的結(jié)合位點(diǎn):生物信息學(xué)分析顯示IFN-λR1中有兩個(gè)STAT5A的結(jié)合位點(diǎn)，分別是位于343～346的“YIEP”氨基酸殘基和位于406～409的“YLAE”氨基酸殘基(圖1A)。IFN-λR1中227～249氨基酸為其跨膜結(jié)構(gòu)域，根據(jù)STAT5結(jié)合位點(diǎn)所在的位置將IFN-λR1膜內(nèi)區(qū)IFN-λR1-ICD分成IFN-λR1-ICDΔ1和IFN-λR1-ICDΔ2。

STAT5A與IFN-λR1、IFN-λR1-ICD、IFN-λR1-ICDΔ1和IFN-λR1-ICDΔ2的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示STAT5A與IFN-λR1中的兩個(gè)截短體IFN-λR1-ICDΔ1和IFN-λR1-ICDΔ2都能相互作用，IFN-λR1含有兩個(gè)STAT5A的結(jié)合位點(diǎn)(圖1B)。

圖1 IFN-λR1中含有兩個(gè)與STAT5A相互作用的位點(diǎn)
A.IFN-λR1截短體示意圖,227～249IFN-λR1為跨膜結(jié)構(gòu)域,343～346IFN-λR1和406～409IFN-λR1為預(yù)測的STAT5結(jié)合位點(diǎn);B.STAT5A與IFN-λR1截短體的相互作用

2.RanBPM與STAT5A相互作用的鑒定:采用免疫共沉淀的方法檢驗(yàn)了RanBPM與STAT5A的相互作用(圖2A)。然后對(duì)RanBPM的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RanBPM中也有兩個(gè)STAT5A的結(jié)合位點(diǎn)，分別是位于177～180的“YIGL”氨基酸殘基和位于526～529的“YCHS”氨基酸殘基，其中“YIGL”位于氨基端的脯氨酸富集區(qū)結(jié)構(gòu)域(pro-rich domain)，“YCHS”位于CTLH結(jié)構(gòu)域和CRA結(jié)構(gòu)域中間(圖2B)。STAT5A與RanBPM的截短體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后，免疫共沉淀結(jié)果顯示含有STAT5A結(jié)合位點(diǎn)的截短體RanBPM-N和RanBPM-C與STAT5A相互作用(圖2C)。

圖2 RanBPM中與STAT5A 相互作用結(jié)構(gòu)域的鑒定
A.STAT5A和RanBPM的相互作用;B.RanBPM截短體示意圖,RanBPM中含有5個(gè)結(jié)構(gòu)域，177～180RanBPM和526～529RanBPM是預(yù)測的STAT5的結(jié)合位點(diǎn);C.STAT5A和RanBPM各個(gè)截短體的相互作用

3.RanBPM影響IFN-λR1與STAT5A的相互作用:IFN-λR1、STAT5A和RanBPM能形成一個(gè)蛋白復(fù)合體，但尚不清楚IFN-λR1的配體IFN-λ1對(duì)這個(gè)蛋白復(fù)合體的形成有何作用。IFN-λR1、STAT5A和RanBPM共轉(zhuǎn)染的情況下，加入IFN-λ1處理12h后，免疫共沉淀與IFN-λR1結(jié)合的蛋白。RanBPM增強(qiáng)IFN-λR1與STAT5A的結(jié)合；加入IFN-λ1刺激后，IFN-λR1與RanBPM，以及IFN-λR1與STAT5A之間的相互作用都明顯增強(qiáng)，但是轉(zhuǎn)染RanBPM組的相互作用更強(qiáng)(圖3)。

圖3 RanBPM增強(qiáng)了IFN-λR1和STAT5的相互作用

4.RanBPM影響STAT5A報(bào)告基因活:為了檢測STAT5A和RanBPM相互作用后對(duì)STAT5A轉(zhuǎn)錄能力的影響，采用雙熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測了STAT5A的轉(zhuǎn)錄能力。在兩株肝癌細(xì)胞Huh 7和Hep 3B細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染RanBPM后，增強(qiáng)了STAT5A的雙熒光素酶報(bào)告基因活性；同時(shí)，在加入IFN-λ1刺激后STAT5A雙熒光素酶報(bào)告基因活性明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4，P<0.05)。

討 論

干擾素根據(jù)其受體的特征，可將干擾素分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3種類型。Ⅰ型干擾素如IFN-α已在在臨床上廣泛用于黑色素瘤、腎癌、毛細(xì)胞性白血病、慢性骨髓性白血病、淋巴瘤和卡波西肉瘤等多種腫瘤的治療[9]。

圖4 RanBPM增強(qiáng)了STAT5A報(bào)告基因活性
A.在huh7細(xì)胞利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測RanBPM對(duì)STAT5A報(bào)告基因活性的影響;B.在Hep3B細(xì)胞中利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測RanBPM對(duì)STAT5A報(bào)告基因活性的影響。*P<0.05

IFNλ包括3個(gè)家族成員IL-28a(IFN-λ2)、IL-28b(IFN-λ3)以及IL-29(IFN-λ1)，他們具有類似的結(jié)構(gòu)[10]。相對(duì)于Ⅰ型干擾素，上皮細(xì)胞中更容易表達(dá)IFN-λ1，因此上皮細(xì)胞中IFN-λ1的特異性受體IFN-λR1也是高表達(dá)的，因此IFN-λ1被認(rèn)為是上皮來源的細(xì)胞因子[11]。IFN-λ1在體內(nèi)外表現(xiàn)出抗病毒，抑制腫瘤增殖以及免疫調(diào)節(jié)的能力。同時(shí)，IFN-λR1的表達(dá)與Ⅰ型干擾素受體不同，具有組織特異性，其在骨髓造血細(xì)胞及腦、脊髓中樞神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)量很低，與目前臨床上普遍應(yīng)用的IFN-α比較，在發(fā)揮生物活性的同時(shí)有效地減少發(fā)熱、抑郁及骨髓抑制等不良反應(yīng)[12]。這也使得IFN-λ可望成為一種新型的免疫生物制劑。因此，深入研究IFN-λ信號(hào)通路中除了活化JAK-STATs等已知的信號(hào)途徑外，是否還有其他的信號(hào)分子參與調(diào)控干擾素的生物學(xué)活性或其信號(hào)途徑，對(duì)于指導(dǎo)其臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)作用。

實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)IFN-λR1能夠與RanBPM相互作用，RanBPM參與調(diào)控IFN-λ信號(hào)途徑，是新的調(diào)控干擾素途徑的蛋白。本研究通過生物信息學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)IFN-λR1中含有兩個(gè)與STAT5A結(jié)合的位點(diǎn)，通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含有結(jié)合位點(diǎn)的截短體參與STAT5A的相互作用；通過分析RanBPM的結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，存在兩個(gè)與STAT5A相互作用的位點(diǎn)，分別位于氨基端的脯氨酸富集區(qū)以及CTLH結(jié)構(gòu)域和CRA結(jié)構(gòu)域中間；免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)RanBPM與STAT5A相互作用。

RanBPM在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核之間的穿梭蛋白，具有核定位和出核序列，更有利于RanBPM在細(xì)胞質(zhì)-細(xì)胞核穿梭，但是其功能尚不完全清楚[13]。現(xiàn)在普遍認(rèn)為RanBPM是一個(gè)腳手架蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞中多個(gè)蛋白的相互作用[14]。RanBPM由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，分別是氨基端富含脯氨酸的結(jié)合SH3的結(jié)構(gòu)域，中間的SPRY結(jié)構(gòu)域和LiSH/CTLH結(jié)構(gòu)域，以及羧基端的CRA結(jié)構(gòu)域。SPRY和CRA兩個(gè)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了與多個(gè)蛋白的相互作用，其中包含多個(gè)受體如雄激素受體、糖皮質(zhì)激素受體和甲狀腺受體等[15]。同時(shí)RanBPM還能與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性，如艾巴病毒早期蛋白R(shí)ta和Zta、TIP60等[16，17]。本研究發(fā)現(xiàn)，RanBPM中含有兩個(gè)STAT5結(jié)合位點(diǎn)，這兩個(gè)位點(diǎn)在SPRY和CRA結(jié)構(gòu)域之外。這就豐富了RanBPM與轉(zhuǎn)錄因子相互作用位點(diǎn)，為RanBPM的轉(zhuǎn)錄共激活功能提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在IFN-λ1刺激下，IFN-λR1、RanBPM和STAT5A之間的相互作用會(huì)增強(qiáng)；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也證明了相互作用增強(qiáng)后，STAT5A的轉(zhuǎn)錄活性也會(huì)增強(qiáng)。哺乳動(dòng)物中有7類STAT分子，分別是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，其中STAT5A和STAT5B蛋白的相似度約為91%[18]。STAT5A和STAT5B可被催乳素、生長因子、白介素、GMCSF等多種因子激活[19]。STAT5參與多個(gè)細(xì)胞功能調(diào)控過程，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化等。STAT5參與調(diào)控NK(natural killer)細(xì)胞的成熟化過程，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的功能[20]。同時(shí)STAT5A的異常激活會(huì)利于腫瘤細(xì)胞的存活和腫瘤的惡性進(jìn)展，參與化療抵抗過程。因此，IFN-λ治療腫瘤的研究中，應(yīng)考慮細(xì)胞中RanBPM對(duì)IFN-λ信號(hào)的調(diào)控作用以及對(duì)STAT5A作用，避免因其過度激活帶來的不良反應(yīng)。