MC4R基因敲除對雌性小鼠代謝和肝臟脂肪性病變的影響

陳小琳 陳 晨

MC4R是中樞調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵受體之一。中樞MC4R與弓狀核(ACR)內(nèi)起降低食欲作用的阿片促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原(POMC)神經(jīng)元合成、分泌的α-黑素細(xì)胞刺激激素(α-MSH)相結(jié)合，起著降低食欲和促進(jìn)能量代謝的作用[1～3]。大量研究表明，Mc4r基因敲除雄性小鼠表現(xiàn)為多食、肥胖和高胰島素血癥[4,5]。肥胖和高胰島素血癥與女性生殖功能密切相關(guān)[6～8]。本研究旨在觀察Mc4r基因敲除對雌性小鼠食欲、體重、血糖、胰島素水平、糖耐量、胰島素敏感度、肝臟脂肪性病變的影響，為研究Mc4r基因敲除對雌性小鼠生殖功能影響提供研究基礎(chǔ)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Mc4r-/-雌性小鼠由Mc4r+/-小鼠交配產(chǎn)生，并進(jìn)行基因鑒定。所有實(shí)驗(yàn)均在澳大利亞昆士蘭大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科學(xué)院陳晨教授實(shí)驗(yàn)室完成。6周齡小鼠兩只一籠飼養(yǎng)，12h光暗周期(光照6:30時(shí)～18:30時(shí))，室溫22±2℃，小鼠自由取水、進(jìn)食。

2.實(shí)驗(yàn)觀察：每天測定小鼠進(jìn)食量和體重。分別在8、12、16、20、26周齡測定空腹、餐后血糖，在8、12、16、20周齡測定空腹、餐后胰島素水平。

3.腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(glucose tolerance tests，GTT)[9]：20周齡，兩組小鼠分別行GTT。小鼠空腹12h，腹腔注射葡萄糖(2g/kg體重)，分別測定注射前及注射后15、30、60、90min末梢血糖。

4.腹腔胰島素耐量實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance tests，ITT)[9]：20周齡，兩組小鼠分別行ITT。小鼠空腹6h，腹腔注射胰島素(0.5U/kg體重)，分別測定注射前及注射后15、30、45min末梢血糖。

5.肝臟脂肪變性的觀察：取新鮮肝組織OCT包埋，冷凍切片(厚12μm)，分別快速HE染色和油紅染色，Aperio ScanScope XT病理掃描系統(tǒng)掃描成像。

結(jié) 果

1.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠攝食和體長的影響:MC4RKO雌性小鼠每日攝食量大于WTLM雌性小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，見圖1。16和28周齡MC4RKO雌性小鼠身長長于WTLM雌性小鼠(圖2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

圖1 小鼠每日攝食量(g)

圖2 小鼠身長(cm)

2.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠體重和內(nèi)臟脂肪的影響：MC4RKO雌性小鼠和WTLM雌性小鼠從8周齡開始體重之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，圖3A)。16、28周齡MC4RKO雌性小鼠皮下脂肪(圖3B)、腹腔脂肪(圖3C)、腹股溝脂肪(圖3D)、卵巢脂肪(圖3E)、腎周脂肪(圖3F)均重于同齡WTLM雌性小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。28周齡MC4RKO雌性小鼠和WTLM雌性小鼠皮下脂肪、腹腔脂肪、腹股溝脂肪、卵巢脂肪、腎周脂肪亦均重于16周MC4RKO雌性小鼠和WTLM雌性小鼠，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.000、<0.01、<0.05)。

3.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠血糖和胰島素水平的影響：8周齡，MC4RKO雌性小鼠和WT LM雌性小鼠兩組之間空腹、餐后血糖和胰島素水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。12、16、20周齡MC4RKO雌性小鼠空腹(圖4A)、餐后血糖(圖4B)和空腹(圖4C)、餐后(圖4D)胰島素水平均高于WTLM雌性小鼠(P值分別為0.000、0.000，<0.01、<0.05)。26周齡，MC4RKO雌性小鼠空腹血糖高于WTLM雌性小鼠野，而餐后血糖兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠葡萄糖耐量和胰島素敏感度的影響：20周齡MC4RKO雌性小鼠顯示葡萄糖耐量異常(圖5A)，葡萄糖曲線下面積(圖5B)大于WTLM雌性小鼠(P值分別為0.000、<0.05)。同時(shí)，與20周齡WTLM雌性小鼠比較，MC4RKO雌性小鼠顯示胰島素敏感度降低(圖5C、D，P值分別為<0.01、<0.05)。

5.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠肝臟重量的影響:16周齡和28周齡MC4RKO雌性小鼠肝臟重量均重于16周齡和28周齡WTLM雌性小鼠，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000),詳見圖6。

6.Mc4r基因敲除對C57/BL6雌性小鼠肝組織學(xué)和肝細(xì)胞脂肪性病變的影響：16周齡(圖7B)、28周齡(圖7D)MC4RKO雌性小鼠肝臟大體觀體積較16周齡(圖7A)、28周齡(圖7C)WTLM雌性小鼠肝臟體積明顯增大，且28周齡(圖7D)MC4RKO雌性小鼠肝臟質(zhì)地較硬，色澤變黃。HE染色光鏡下觀察，16周齡(圖7E)和28周齡(圖7G)WTLM雌性小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝小葉正常，肝細(xì)胞呈多形、排列成肝索，呈放射狀分布。16周齡(圖7F)MC4RKO雌性小鼠肝臟HE染色光鏡下發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞體積增大，肝索排列稍紊亂，胞質(zhì)中有脂滴空泡；28周齡(圖7H)MC4RKO雌性小鼠肝細(xì)胞體積變小，肝索排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，胞質(zhì)中有大量脂滴空泡。油紅染色光鏡下觀察，16周齡(圖7I)、28周齡(圖7K)WTLM雌性小鼠肝細(xì)胞未見紅色脂滴，16周齡(圖7J)MC4RKO雌性小鼠肝細(xì)胞可見大量細(xì)小紅色脂滴，28周齡(圖7L)MC4RKO雌性小鼠肝細(xì)胞可見大量較大紅色脂滴。

圖3 小鼠體重和內(nèi)臟脂肪含量
A.體重;B.皮下脂肪;C.腹腔脂肪;D.腹股溝脂肪;E.卵巢脂肪;F.腎周脂肪；*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000

圖4 小鼠血糖和胰島素水平
A.空腹血糖；B.餐后血糖；C.空腹胰島素；D.餐后胰島素；*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

圖5 葡萄糖耐量和胰島素耐量
A.腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn);B.葡糖糖曲線下面積;C.腹腔胰島素耐量試驗(yàn);D.相對葡萄糖曲線下面積；*P<0.05,**P<0.01，***P=0.000

圖6 小鼠肝臟重量

討 論

肥胖引起女性生殖內(nèi)分泌紊亂是導(dǎo)致育齡女性不孕的主要原因。確切發(fā)病機(jī)制尚未闡明。到目前為止，還沒有一個(gè)廣泛公認(rèn)的動(dòng)物模型用于研究其發(fā)病機(jī)制、病程發(fā)展、臨床治療和預(yù)防。下丘腦是中樞調(diào)控能量代謝和生殖的關(guān)鍵部位。MC4R屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族(GPCRs)成員之一, 分布在大腦皮質(zhì)、下丘腦、垂體、性腺，具有雌雄間差異[10,11]。黑皮質(zhì)素4受體(MC4R)是下丘腦控制食欲和促進(jìn)能量代謝的關(guān)鍵分子[12～14]。已有研究證實(shí)，Mc4r基因敲除的雄性小鼠表現(xiàn)為多食、肥胖和高胰島素血癥。本研究以MC4RKO雌性小鼠為研究對象，觀察MC4R基因敲除對雌性小鼠能量代謝和肝臟的影響。

圖7 小鼠肝臟組織學(xué)
A～D.大體標(biāo)本；E～H.HE染色(×200);I～L.油紅染色(×200)

本研究結(jié)果顯示，MC4RKO雌性小鼠表現(xiàn)為多食、體長增加、肥胖，尤其是內(nèi)臟脂肪增加。MC4RKO雌性小鼠在12周齡出現(xiàn)血糖、胰島素水平顯著升高。26周齡基因敲除小鼠和野生型小鼠兩組間餐后血糖比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測分析可能與基因敲除小鼠此時(shí)已表現(xiàn)為嚴(yán)重肝臟脂肪性病變有關(guān)。20周齡MC4RKO雌性小鼠已顯示糖耐量異常和嚴(yán)重胰島素抵抗。MC4RKO雌性小鼠在16周齡時(shí)已出現(xiàn)肝臟腫大和脂肪性病變，28周齡時(shí)肝臟已顯示出重度脂肪肝和肝硬化。因而，MC4RKO雌性小鼠可以作為雌性肥胖動(dòng)物模型進(jìn)行代謝性疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。

肥胖引起女性生殖內(nèi)分泌紊亂的機(jī)制以及肥胖的表型復(fù)雜，一種動(dòng)物模型不能解釋所有肥胖表型導(dǎo)致的機(jī)體功能異常。由于本實(shí)驗(yàn)中MC4RKO雌性小鼠攝入的是普通動(dòng)物飼料導(dǎo)致肥胖，該模型更適合用于因食欲亢進(jìn)導(dǎo)致肥胖的動(dòng)物模型研究。該動(dòng)物模型是否存在生殖功能異常，何時(shí)出現(xiàn)生殖功能紊亂，與生殖相關(guān)的激素如何變化，還需要進(jìn)一步研究。