低分子姬松茸多糖對D-半乳糖致衰老大鼠的保護作用

樊 麗 許景偉 李世玲 李雪巖 馬立威

隨著人口老齡化問題日趨嚴(yán)峻，衰老和延緩衰老是當(dāng)今社會共同關(guān)注的問題，其中腦老化是機體衰老的重要表現(xiàn)。學(xué)習(xí)記憶能力下降甚至阿爾茨海默癥、帕金森病等發(fā)生率呈逐年上升趨勢[1]。海馬是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的主要腦區(qū)，易受氧化損傷的影響，體內(nèi)高氧化應(yīng)激狀態(tài)可導(dǎo)致衰老的觀點得到較為廣泛的認(rèn)同[2，3]，因此，抗氧化可以有效防治腦衰老的發(fā)生、發(fā)展。姬松茸又名巴西蘑菇，是珍貴的食藥兼用的真菌。富含多糖、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，姬松茸多糖是從其子實體中分離提取的β型葡聚糖，低相對分子質(zhì)量多糖(<50000)較高相對分子質(zhì)量多糖易于進行結(jié)構(gòu)修飾，具有通過結(jié)構(gòu)改造提高藥效的潛在價值。LMPAB具有增強免疫，抗氧化及抗腫瘤等效應(yīng),但其抗衰老的研究鮮見報道，本研究采用皮下注射D-半乳糖制造大鼠衰老模型，通過水迷宮等行為學(xué)實驗，氧化相關(guān)指標(biāo)及細(xì)胞凋亡的檢測等，觀察低分子姬松茸多糖對D-半乳糖致衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶及抗氧化的影響[4～6]。

材料與方法

1.實驗動物:SD大鼠50只，雄性，無特定病原體(SPF)級，3月齡，體質(zhì)量180～200g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。實驗動物許可證號：SYXK(黑)2016-001。飼養(yǎng)環(huán)境安靜，自然通風(fēng)，室溫25℃，相對濕度45%～75%。光線正常明暗交替，自由進食，飲水。

2.藥品與試劑:LMPAB(純度≥95%，批號SXJR170311-16)購自陜西金潤生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷肌甘肽過氧化物酶(glutathione-PX GSH-PX)、丙二醛(MDA)和蛋白含量檢測試劑盒購自南京建成生物公司；β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

3.儀器:FACS Calibur流式細(xì)胞儀，購自美國BD公司； Safire 2酶標(biāo)儀，購自奧地利Tecan公司；Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)，購自成都儀器廠；大鼠避暗儀IXeye ShuttleBox穿梭避暗實驗系統(tǒng)，購自成都泰盟軟件技術(shù)有限公司；倒置熒光顯微鏡，購自德國Zeiss公司。

4.動物分組與衰老模型建立：SPF級SD大鼠50只，雄性，3月齡，體質(zhì)量180～200g。隨機分為正常對照組，衰老模型組，LMPAB組(100、200、400mg/kg)，每組10只。衰老模型組皮下注射D-半乳糖(300mg/kg)每天1次連用42天; LMPAB組注射D-半乳糖劑量與時間同衰老模型組，同時腹腔分別注射LMPAB；正常對照組皮下及腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液每天1次連用42天。經(jīng)水迷宮實驗驗證造模成功。

5.Morris水迷宮實驗：Morris水迷宮是測量嚙齒類動物空間學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典方法。儀器主要由一直徑為120cm、高50cm的圓形水池和一可移動位置的平臺組成，水池上空通過一攝像機與監(jiān)視器和計算機連接。水池里水溫控制在23±2℃，平臺、水、池壁均染成黑色以隱蔽平臺，水中不能明顯見到安全平臺。水池等分為 4 個象限，將平臺放在第3象限中間，在4個象限中點位置分別將大鼠面向水池壁放入水中。實驗過程中水池及周圍環(huán)境保持不變。當(dāng)設(shè)定的訓(xùn)練時間已到或大鼠已爬到平臺，計算機停止跟蹤并記錄下游泳軌跡和自動計算出大鼠在水池中所游過的路程、時間、速度等。實驗歷時4天，每天每只鼠訓(xùn)練4次，第5天去除平臺，任選一個入水點將大鼠放入水中，記錄60s。

6.避暗反應(yīng)實驗：實驗前先將大鼠放入避暗儀反應(yīng)箱中訓(xùn)練5min，正式測試開始時將大鼠背對洞口放入明室，大鼠進入暗室則受到交流電電擊，避暗儀自動記錄5min內(nèi)大鼠進入暗室的次數(shù)(即錯誤次數(shù))和首次進入暗室前在明室的停留時間(即避暗潛伏期)。共測試7天，記錄5min內(nèi)錯誤次數(shù)和避暗潛伏期，將每只大鼠7次結(jié)果的均值進行統(tǒng)計分析。

7.海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測：制備單細(xì)胞懸液，用冷的PBS洗滌細(xì)胞，用 1ml 1×的 Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，300×g離心10min，棄上清，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/毫升，每管加入100μl細(xì)胞。再向管中加入5μl AnnexinV-FITC。 室溫，避光，輕輕地混勻，10min。加入5μl PI，室溫，避光，孵育5min。加入PBS至500μl，輕輕混勻。在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

8.腦組織氧化指標(biāo)的測定:大鼠行為學(xué)實驗結(jié)束后24h，將各組大鼠脫臼處死，迅速取左側(cè)大腦組織置于冰上，制成10%組織勻漿，按照試劑盒說明書測定腦組織SOD、GSH-PX活力和MDA的含量。

9.SA-β-gal染色:每組隨機選取5只大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，按文獻[5]的方法進行腦組織切片的制備。常規(guī)方法進行脫蠟和水化處理切片，加入適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ?5min,用PBS洗滌3次，每次不少于5min，吸棄PBS，加入適當(dāng)?shù)娜旧ぷ饕海?7℃過夜，顯微鏡下觀察。

結(jié) 果

1.LMPAB對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響:與對照組比較，模型組大鼠在中央活動路程，站臺周邊路程及站臺周邊時間明顯減少，平均速度明顯降低(P<0.01)，逃避潛伏期明顯縮短，錯誤次數(shù)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，LMPAB高劑量組，中央活動路程，站臺周邊路程及站臺周邊時間明顯增多，平均速度明顯增快(P<0.01)，逃避潛伏期明顯延長，錯誤次數(shù)明顯減少(P<0.01)，詳見圖1、表1。

圖1 各組大鼠空間探索實驗軌跡
A.正常對照組；B.模型組；C.LMPAB低劑量組；D.LMPAB中劑量組；E為LMPAB高劑量組

組別劑量(mg/kg)中央活動路程(cm)站臺周邊路程(cm)站臺周邊時間(s)平均速度(cm/s)正常對照組-489.55±74.551185.64±56.5051.22±2.4132.13±1.04模型組-49.54±21.10??347.27±90.31??32.80±3.59?? 13.40±4.65??LMPAB低劑量組100104.98±34.54?? 477.06±51.40?? 37.00±0.94?? 19.13±2.15??#LMPAB中劑量組200237.34±35.73??##765.47±38.49??##43.45±2.79?##23.77±1.21??##LMPAB高劑量組400374.55±56.24##1071.36±47.51##45.68±2.60##29.32±2.11##

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

2.海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果：與對照組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，LMPAB高劑量組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01)，詳見圖2、表1。

圖2 各種大鼠海馬神經(jīng)元凋亡實驗結(jié)果
A.正常對照組；B.模型組；C.LMPAB低劑量組；D.LMPAB中劑量組；E.LMPAB高劑量組

3.MDA含量、SOD、GSH-PX活性測定：與對照組比較，模型組MDA含量明顯增多(P<0.01)，SOD、CAT、GSH-PX活性顯著下降(P<0.01)，與模型組比較，LMPAB組MDA含量減少(P<0.01)，SOD、CAT、GSH-PX活性均增高(P<0.01)，且有濃度依賴性，尤其是LMPAB高劑量組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，詳見表2。

表2 避暗反應(yīng)及細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

4.各組腦組織切片SA-β-gal染色結(jié)果：衰老細(xì)胞胞質(zhì)被染成藍色，SA-β-gal陽性區(qū)域強度用相對吸光度值表示，與對照組比較，模型組相對吸光度值顯著增高，與模型組比較，LMPAB組相對吸光度值明顯降低，且有劑量依賴性，隨劑量的增大相對吸光度值降低，詳見圖3、圖4。

表3 各組大鼠海馬區(qū)MDA含量及SOD、GSH-PX活性

與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

圖3 LMPAB對衰老大鼠海馬區(qū)SA-β-gal染色的影響(×200)
A.正常對照組；B.模型組；C.LMPAB低劑量組；D.LMPAB中劑量組；E.LMPAB高劑量組

圖4 LMPAB對衰老模型大鼠海馬SA-β-gal的比較
與正常對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

討 論

多糖具有提高免疫力，抗氧化、抗腫瘤等功效，已成為國內(nèi)外研究熱點[7～9]。與衰老相關(guān)的疾病如冠心病、糖尿病、阿爾茨海默病及帕金森病等發(fā)生率呈逐年上升趨勢。衰老的主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，海馬是與之密切相關(guān)的腦區(qū)[10]。D-gal衰老模型大鼠是研究抗衰老、改善學(xué)習(xí)記憶能力的經(jīng)典的動物模型[11]。

本研究通過大鼠行為學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)低分子姬松茸多糖能夠改善衰老模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮實驗顯示，與模型組比較，LMPAB高劑量組明顯提高了中央活動區(qū)及平臺周圍的活動路程，延長了平臺周圍活動時間，提高了平均速度。避暗反應(yīng)實驗顯示，LMPAB高劑量組明顯延長了潛伏期，減少了錯誤次數(shù)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，D-gal致衰老模型大鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)具有細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征，核膜出現(xiàn)分葉狀凹陷，核質(zhì)濃縮，邊集等，提示細(xì)胞凋亡可能參與衰老的病變過程。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，LMPAB高劑量組凋亡率明顯降低，提示LMPAB具有減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的功能。

正常情況下，機體的氧化與抗氧化能力是處于動態(tài)平衡的，D-gal的氧化機制是氧自由基(超氧陰離子、過氧化氫)在體內(nèi)累積過量，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生過量的MDA，其含量的高低可以間接地反映細(xì)胞受損害的程度，使得抗氧化酶SOD、GSH-PX活性降低，SOD可以使體內(nèi)超氧陰離子歧化生成過氧化氫，以減少自由基對細(xì)胞的損傷；GSH-PX是機體內(nèi)廣泛存在的重要的催化過氧化氫分解的酶，可以起到保護細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。本研究顯示，與模型組比較，LMPAB高劑量組SOD、GSH-PX活性明顯升高，MDA含量明顯降低，提示LMPAB能夠有效清除D-gal誘發(fā)的氧自由基繼而減輕對大鼠海馬組織的氧化損傷。

衰老模型組腦切片SA-β-gal染色相對光密度值較正常組顯著增加，表明衰老細(xì)胞明顯增多，LMPAB組尤其高劑量腦切片SA-β-gal染色相對吸光度值較模型組明顯降低，提示LMPAB能夠明顯改善衰老狀態(tài)[12]。

綜上所述，LMPAB能有效預(yù)防因衰老而產(chǎn)生的氧化損傷，改善神經(jīng)退行性病變及學(xué)習(xí)記憶能力，為開發(fā)預(yù)防衰老及神經(jīng)退行性變、提高學(xué)習(xí)記憶能力的藥物提供了理論基礎(chǔ)，其相關(guān)機制有待于進一步研究。