長鏈非編碼RNA MIF-AS1在肝癌中表達及其與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

胡走肖，鄭小林

（華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 武漢 430014）

肝細胞癌（HCC，以下簡稱肝癌）具有復(fù)發(fā)率高和預(yù)后差的特點[1]，手術(shù)切除被認為是最有效的治療方法，但手術(shù)也易于促進腫瘤的微轉(zhuǎn)移[2]。研究肝癌潛在的分子機制對尋找肝癌治療靶點和指導(dǎo)治療具有重要價值[3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度在200個核苷酸且沒有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，其可通過染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)來影響細胞生物學(xué)功能[4]，參與多種腫瘤的發(fā)生和進展[5]。lncRNA MIF-AS1是最新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在胃癌組織中表達上調(diào)且與患者不良預(yù)后相關(guān)[6]。lncRNA MIF AS1在肝癌中的表達及其功能尚無研究報道。本研究采用實時熒光定量PCR檢測94例肝癌患者癌組織中l(wèi)ncRNA MIF-AS1表達，分析其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后關(guān)系，并在細胞系中探討lncRNA MIF AS1對肝癌細胞增殖和侵襲能力的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 臨床標本

收集2014年1月—2015年1月間于華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院肝膽外科行肝癌切除術(shù)患者組織標本94例。納入標準：⑴ 術(shù)前未進行任何放化療、肝動脈栓塞化療、射頻消融治療或免疫治療；⑵ 術(shù)后病理學(xué)確診為肝癌；⑶ 切緣無癌殘留；⑷ 臨床及隨訪資料完整。排除標準：⑴ 患者除肝癌外存在其他部位腫瘤；⑵ 缺乏隨訪資料或隨訪資料不完整者；⑶ 病理組織標本不符合研究的患者。手術(shù)切除的肝癌病理組織需完整包括癌組織及相應(yīng)癌旁組織，癌旁組織距腫瘤邊緣至少2 cm以上且病理證實無癌細胞殘余，將符合條件的病理標本存于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 臨床資料收集和隨訪

收集患者年齡、性別、病理類型、腫瘤大小和血清甲胎蛋白（AFP）等信息；術(shù)后隨訪采用定期門診復(fù)診和電話隨訪進行。隨訪內(nèi)容包括：術(shù)后疾病進展情況（進展、復(fù)發(fā)或死亡）、影像學(xué)檢查變化、血清AFP水平、肝功能等?；颊咴\斷復(fù)發(fā)定義如下：術(shù)后經(jīng)兩種影像學(xué)檢查證實存在肝癌特征性的占位病變，或一種影像學(xué)檢查提示存在肝癌特征性占位病變，同時伴有AFP持續(xù)性增高[7]。術(shù)后無瘤生存時間為手術(shù)日至確診復(fù)發(fā)或末次隨訪之間的時間間隔，術(shù)后總生存時間為手術(shù)治療日起至死亡之間時間，隨訪截至時間為2019年1月，最長隨訪時間5年。

1.3 主要試劑及儀器

RNAiso plus（9109）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）及qRT-PCR試劑盒（RR420）均購自日本Takara公司；Transwell小室、基質(zhì)膠Matrigel（BD）；ThermoND2000C超微量分光光度計（Thermo）、GeneAmp PCR system 9700擴增儀（PerkinElmer）、LightCycler?480 IISystem（Roche）。EMT相關(guān)抗體（抗波形蛋白、抗N-鈣黏附蛋白和抗E-鈣黏附蛋白）購自美國Abcam公司。lncRNA MIF-AS1干擾序列、lncRNA MIF-AS1模擬物及陰性對照序列由廣州銳博生物科技有限公司合成。lncRNA MIF-AS1干擾序列：5'-GGT GGT TGA AAG GAA TCC T-3'；陰性對照序列：5'-CCT AAG GTT AAG TCG CCC TC-3'；lncRNA MIF-AS1模擬物正向：5'-CGU GUA UUU GAC AAG CUG AGU U-3'，反向：5'-CUC AGC UUG UCA AAU ACA CGU U-3'。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)人肝癌細胞株（QGY-7703、BEL-7404、MHCC-LM3、SK-hep1和 HepG2）及人肝細胞系（L02）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，將上述細胞株置于37 ℃、5%CO2溫育箱中，取處于對數(shù)生長期且生長良好細胞用于實驗。

1.4.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組取對數(shù)生長期的QGY-7703細胞接種于6孔板（5×105/孔）中待生長至匯合度為70%～80%時，分成：沉默組、過表達組和對照組，遵照Lipofectamine3000說明書要求分別轉(zhuǎn)染lncRNA MIF-AS1干擾序列、lncRNA MIFAS1模擬物及陰性對照序列，轉(zhuǎn)染后12 h采用qRT-PCR檢測lncRNA MIF-AS1表達以確定轉(zhuǎn)染效率。

1.4.3 CCK-8實驗肝癌細胞株（QGY-7703）轉(zhuǎn)染后24 h，接種于96孔板中（5×103/孔），分別在 0、24、48、72 h后加入 CCK-8（10 μL/孔），避光培養(yǎng)2 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測450 nm波長處的吸光度，吸光度值為縱坐標，處理時間為橫坐標，繪制細胞生長曲線。

1.4.4 Transwell試驗肝癌細胞株（QGY-7703）轉(zhuǎn)染24 h后，采用胰酶消化細胞并離心棄上清，用無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:8比例 稀 釋 50 mg/L 的 Matrigel后，加 50 μL 稀 釋后的Matrigel包被Transwell小室底部膜，將1×105/100 μL細胞懸液接種到上室，下室加500 μL含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，48 h后取出小室，棄上室培養(yǎng)基，用棉簽拭掉上室的細胞，4%多聚甲醛固定細胞15 min，結(jié)晶紫染色10 min，PBS漂洗3次，鏡檢穿出小室的細胞數(shù)目。

1.4.5 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取適量腫瘤組織至 1 mL RNAiso plus 中研磨充分后加 200 μL氯仿劇烈震蕩 15 s，室溫靜置 10 min，4 ℃離心（12 000 r/min，15 min）；取上清并按等體積加入異丙醇，顛倒混勻，4 ℃離心后收集沉淀；加1 mL 75%乙醇洗滌后晾干；加DEPC水溶解至適宜濃度后采用分光光度計測量總RNA濃度，A260/280在1.8～2.0之間為合格樣品。按Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RR036A說明書所述加入試劑，使用 SureCycler 8800 PCR 儀（Agilent Technologie）行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.6 qRT-PCRlncRNA MIF-AS1引物序 列由上海生工生物工程股份有限公司合成。lncRNA MIF-AS1 上游引物：ACA TCG GCA TGA TGG CAG AA；下游引物：TCA CAA AAG GCG GGA CCA C；GAPDH 為內(nèi)參，上游引物：GTA ACC CGT TGA ACC CCA TT；下游引物：CCA TCC AAT CGG TAG TAG CG。實時熒光定量 PCR 的反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95 ℃ 30 s，之后40個循環(huán)（95 ℃ 5 s、65 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s）。結(jié)果分析采用2-ΔΔCT法行基因表達相對定量分析。

1.4.7 Western blot使用RIPA緩沖液提取3組細胞總蛋白質(zhì)，使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白質(zhì)含量。用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠分離3組的蛋白質(zhì)樣品（30 μg），并轉(zhuǎn)移到PDVF膜。用Tris緩沖鹽水中的5%脫脂牛奶封閉膜，并與抗波形蛋白，抗N-鈣黏附蛋白，抗E-鈣黏附蛋白孵育并在4 ℃過夜，然后二抗37 ℃孵育2 h。使用化學(xué)發(fā)光液（ECL）顯現(xiàn)印跡，采用GAPDH為上樣對照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用IBM SPSS20.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，采用χ2檢驗分析肝癌組織中l(wèi)ncRNA MIFAS1表達與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并通過Log-rank檢驗比較lncRNA MIF-AS1高表達及低表達組患者術(shù)后生存率差異。采用Cox比例風險模型分析影響患者預(yù)后的獨立危險因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 lncRNA MIF-AS1在肝癌組織和肝細胞系中表達上調(diào)

qRT-PCR結(jié)果示：癌組織中l(wèi)ncRNA MIFAS1表達明顯高于正常癌旁組織（P＜0.001）（圖1A）；5種肝癌細胞株中l(wèi)ncRNA MIF-AS1表達水平均明顯高于正常肝細胞株（L02）（均P＜0.001）（圖1B）。

圖1 lncRNA MIF-AS1在肝癌中的表達 A：肝癌組織和癌旁組織；B：肝細胞株與正常肝細胞Figure1 Expression of lncRNA MIF-AS1 in HCC A:HCC tissue and tumor adjacent tissue；B:HCC cell lines and normal hepatic cells

2.2 lncRNA MIF-AS1表達與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

根據(jù)肝癌組織中l(wèi)ncRNA MIF-AS1表達量的中位數(shù)將所有病例分為高表達組和低表達組，其中高表達組47例，低表達組47例。lncRNA MIF-AS1的表達水平與患者AFP水平（P=0.012）、腫瘤大?。≒=0.006）、門靜脈微癌栓（P=0.011）、TNM分期（P=0.030）明顯有關(guān)，而與性別、年齡、肝硬化、組織分化、腫瘤數(shù)量、包膜無明顯關(guān)系（均P＞0.05）（表1）。

表1 lncRNA MIF-AS1表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n（%）]Table1 Association between lncRNA MIF-AS1 expression and clinicopathologic parameters of the patients[n (%)]

2.3 lncRNA MIF-AS1表達水平與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系

圖2 lncRNA MIF-AS1高表達組和低表達組術(shù)后無瘤生存率和總生存率比較Figure2 Disease-free survival and Overall survival curve of lncRNA MIF-AS1 high expression group and low expression group

Kaplan-Meier生存分析示，lncRNA MIF-AS1高表達組術(shù)后無瘤生存率明顯低于lncRNA MIFAS1低表達組（P＜0.001）（圖2A）；lncRNA MIF-AS1高表達組術(shù)后總生存率明顯低于lncRNA MIF-AS1低表達組（P＜0.001）（圖2B）。

2.4 肝癌術(shù)后無瘤生存率和總生存率的危險因素分析

單因素分析顯示：腫瘤大?。≒=0.001）、腫瘤數(shù)目（P=0.0 2 3）、門靜脈微癌栓（P＜0.001）、分化程度（P=0.001）及l(fā)ncRNA MIF-AS1表達（P＜0.001）與患者無瘤生存率明顯有關(guān)；多因素分析示：腫瘤數(shù)目（P=0.01）、門靜脈微癌栓（P=0.006）、分化程度（P=0.037）及l(fā)ncRNA MIF-AS1表達（P=0.001）為影響患者無瘤生存率的獨立危險因素（表2）。Cox單因素回歸分析顯示：有無門靜脈微癌栓（P=0.012）、病理分化程度（P=0.013）及l(fā)ncRNA MIF-AS1的相對表達水平（P＜0.001）與患者總生存率明顯有關(guān)，多因素回歸分析顯示：門靜脈微癌栓（P=0.043）、病理分化程度（P=0.027）及l(fā)ncRNA MIF-AS1相對表達水平（P=0.001）為患者總生存率的獨立預(yù)后因素（表3）。

表2 無瘤生存率的影響因素分析（n=94）Table2 Univariate and multivariate analysis of influencing recurrence-free survival of the patients (n=94)

表3 影響患者總生存率的單因素和多因素分析（n=94）Table3 Univariate and multivariate analysis of influencing overall survival of the patients (n=94)

2.5 lncRNA MIF-AS1調(diào)節(jié)肝癌增殖

qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，過表達組lncRNA MIF-AS1相對表達明顯升高，沉默組lncRNA MIF-AS1相對表達量明顯降低（均

圖3 轉(zhuǎn)染效果檢測Figure3 Transfection effect measurement

2.6 lncRNA MIF-AS1調(diào)節(jié)肝癌侵襲

與對照組比較，過表達組細胞侵襲數(shù)目明P＜0.01）（圖3），提示轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染24、48及72 h后，與對照組比較，過表達組A450 nm值明顯升高，沉默組A450 nm值明顯降低（均P＜0.01）（圖4）。顯增多，而沉默組細胞侵襲數(shù)目明顯減少（均P＜0.01）（圖5）。

圖4 lncRNA MIF-AS1表達對肝癌細胞增殖能力的影響Figure4 Effect of lncRNA MIF-AS1 on the proliferation of HCC cells

圖5 lncRNA MIF-AS1表達對肝癌細胞侵襲的影響Figure5 Effect of lncRNA MIF-AS1 expression on invasion of HCC cells

2.7 lncRNA MIF-AS1表達與肝癌細胞EMT相關(guān)分子的關(guān)系

Western blot結(jié)果顯示：與對照組比較，沉默組E-鈣黏附蛋白表達量明顯升高、N-鈣黏附蛋白與波形蛋白蛋白表達量明顯降低（均P＜0.05）；過表達組E-鈣黏附蛋白表達量明顯降低，N-鈣黏附蛋白與波形蛋白蛋白表達量明顯升高（均P＜0.05）（圖6）。

圖6 lncRNA MIF-AS1表達對肝癌細胞EMT相關(guān)分子的影響Figure6 Influence of lncRNA MIF-AS1 expression on EMT-related molecules in HCC cells

3 討 論

肝癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率在所有腫瘤中居第5位，在腫瘤相關(guān)死亡中排第2位[8-10]。我國每年約有38.3萬人死于肝癌，嚴重危害國人健康，深入研究肝癌發(fā)病機制對肝癌治療尤為重要[11-12]。lncRNA是一類長度大于200 nt無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子。近年來研究發(fā)現(xiàn)其在腫瘤進展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥方面發(fā)揮重要作用[13-14]。lncRNA可在肝癌患者的腫瘤組織中異常表達，并可能預(yù)測肝癌患者的預(yù)后，為治療肝癌新的潛在分子靶點[15-17]。

lncRNA MIF-AS1定位于1p36染色體上，是最新發(fā)現(xiàn)的lncRNA分子[18]。本研究檢測lncRNA MIF-AS1在肝癌組織中的表達水平，發(fā)現(xiàn)癌組織中l(wèi)ncRNA MIF-AS1的表達水平顯著高于癌旁組織，同時發(fā)現(xiàn)不同肝癌細胞株中l(wèi)ncRNA MIF-AS1的表達水平也顯著高于正常肝細胞株，上述結(jié)果顯示肝癌癌組織和細胞株中l(wèi)ncRNA MIF-AS1的表達均上調(diào)。這與在胃癌[6]及乳腺癌[18]中的報道一致。本研究發(fā)現(xiàn)肝癌癌組織中l(wèi)ncRNA MIF-AS1的表達水平與AFP、腫瘤大小、門靜脈微癌栓、TNM分期顯著相關(guān)；lncRNA MIF-AS1高表達組患者無瘤生存率和總生存率均較低表達組患者顯著性降低，Cox回歸分析示lncRNA MIF-AS1的表達水平是影響肝癌患者術(shù)后無瘤生存率和總生存率的獨立危險因素；上述結(jié)果提示lncRNA MIF-AS1的表達水平是與肝癌疾病嚴重狀態(tài)相關(guān)且可預(yù)測肝癌預(yù)后的分子標志物。

本研究采用特異性靶向干擾RNA轉(zhuǎn)染肝癌細胞株后導(dǎo)致lncRNA MIF-AS1功能喪失和獲得實驗發(fā)現(xiàn)敲低lncRNA MIF-AS1表達可顯著抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力；反之，lncRNA MIFAS1過表達可顯著增強肝癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，提示lncRNA MIF-AS1可能在肝癌發(fā)揮致癌基因的作用。本研究結(jié)果與文獻報道lncRNA MIF-AS1在胃癌及乳腺癌中發(fā)揮致癌基因作用類似。在胃癌中，作者證實lncRNA MIF-AS1能通過lncMIF-AS1/miR-212-5p/NDUFA4信號途徑促進胃癌增殖，并抑制凋亡[6]。在乳腺癌中，lncRNA MIF-AS1高表達，并可通過靶向結(jié)合miR-1249-3p，調(diào)控Homeobox B8的表達。沉默lncRNA MIF-AS1表達可抑制乳腺癌細胞增殖、克隆形成和遷移，抑制EMT過程[18]。

Western blot結(jié)果顯示，lncRNA MIF-AS1過表達可導(dǎo)致肝癌細胞中代表間質(zhì)的N-鈣黏附蛋白和波形蛋白表達增加，而代表上皮表型的E-鈣黏附蛋白表達降低，反之亦然，結(jié)果提示lncRNA MIF-AS1參與肝癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）過程調(diào)節(jié)。EMT是腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的基礎(chǔ)，主要特征是上皮標志物E-鈣黏附蛋白表達下調(diào)、間質(zhì)標志物N-鈣黏附蛋白和波形蛋白等表達上調(diào)，致使細胞間鏈接喪失、黏附能力減弱，細胞遷移和侵襲能力增強[19-21]。研究[22-24]表明眾多l(xiāng)ncRNA可通過調(diào)控EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達影響癌癥的EMT進程，lncRNA NRON在肝癌組織中表達下調(diào)并通過調(diào)節(jié)EMT過程，體外抑制肝癌細胞遷移和侵襲[25]。本研究中l(wèi)ncRNA MIF-AS1過表達后促進EMT過程，肝癌細胞侵襲能力顯著增強，提示lncRNA MIF-AS1在肝癌中可通過促進EMT進程而增強肝癌細胞的侵襲能力，從而影響肝癌的發(fā)生發(fā)展，也可能是導(dǎo)致lncRNA MIF-AS1高表達水平的患者具有不良預(yù)后的原因之一。盡管如此，lncRNA MIF-AS1調(diào)節(jié)EMT過程的潛在靶分子和及在動物體內(nèi)的機制尚需要進一步研究。

綜上所述，肝癌組織中l(wèi)ncRNA MIF-AS1的表達上調(diào)，其表達水平與肝癌預(yù)后相關(guān)，是肝癌預(yù)后獨立危險因素。lncRNA MIF-AS1可能發(fā)揮致癌基因作用而調(diào)節(jié)肝癌侵襲能力和促進EMT進程。