白藜蘆醇通過TLR4通路對H9C2細(xì)胞高糖缺氧/復(fù)氧損傷的作用

近年來，研究發(fā)現(xiàn)在心肌缺血再灌注(I/R)時，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損引起活性氧物質(zhì)的生成，導(dǎo)致細(xì)胞因子、炎性組織因子等發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而引起心肌組織結(jié)構(gòu)和功能障礙[1]。而糖尿病時，機體也可通過多種機制和信號途徑促進(jìn)心肌細(xì)胞及其間質(zhì)纖維化，促進(jìn)心肌重構(gòu)[2]。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是連接先天性免疫與獲得性免疫的橋梁，Toll 樣受體4 (Toll like receptor 4，TLR4)作為TLRs家族中的一員，已被越來越多的研究證實其在非感染性疾病中具有促進(jìn)炎癥的作用[3]。

白藜蘆醇(RES)是一種存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類化合物，研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗炎、抗氧化等生物學(xué)作用，可抑制由于缺血、缺氧等導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡，對心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[4-8]。本實驗以H9C2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷及高糖處理為模型，旨在從細(xì)胞水平探討白藜蘆醇通過TLR4途徑對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)和高糖后處理心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 H9C2細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞購置于武漢博士德生物公司，使用DMEM完全培養(yǎng)基(10%FBS和1%雙抗)，37 ℃，5%CO2，高濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 主要儀器和試劑 DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone，美國)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，細(xì)胞培養(yǎng)皿(Costar，美國)，低溫高速離心機(Thermo，美國)，白藜蘆醇(Sigma，美國)，乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，購自江蘇科特生物科技有限公司，CCK8細(xì)胞增殖檢測試劑盒、AnnexinV/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠TLR4單克隆抗體、辣根過氧物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG、 兔抗鼠β-actin 單克隆抗體，購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組和細(xì)胞處理 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔按4×103個接種至96 孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)，待細(xì)胞貼壁后按照分組方案進(jìn)行相應(yīng)處理。本研究將細(xì)胞分為6組，對照組：心肌細(xì)胞按正常培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)，不加任何刺激；缺氧/復(fù)氧組：缺氧3 h，復(fù)氧2 h，時間開始點為鋪板后48 h；缺氧/復(fù)氧+RES組：缺氧3 h，復(fù)氧2 h，時間開始點為鋪板后48 h，復(fù)氧開始5 min 后加入藥物，一直到2 h；高糖組：高糖濃度為100 mmol/L，處理時間為48 h；高糖+缺氧/復(fù)氧組：高糖濃度為100 mmol/L，處理時間為48 h，高糖處理完后，按缺氧/復(fù)氧處理，缺氧3 h，復(fù)氧2 h；高糖+缺氧/復(fù)氧+RES組：高糖濃度為100 mmol/L，處理時間為48 h，按缺氧/復(fù)氧處理，缺氧3 h，復(fù)氧2 h，白藜蘆醇濃度為25μmol/L，在復(fù)氧開始5min 后加入，一直到2 h。

1.3.2 CCK8檢測細(xì)胞增殖 將處理過的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的含10 μL 的毒性檢測液CCK8，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育3 h，用酶標(biāo)儀測波長為450 nm 的吸光度。

1.3.3 AnnexinV/PI檢測細(xì)胞凋亡率 調(diào)整待檢測細(xì)胞濃度為106個/mL，取200 μL，1 000 r/min離心5 min(4 ℃)；預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)1 mL潤洗兩次，1 000 r/min離心5 min(4 ℃)；將細(xì)胞重懸于100 μL結(jié)合緩沖液，加入2 μL Annexin-V-FITC (20 μg/mL)，輕輕混勻，避光冰上放置15 min；轉(zhuǎn)至流式檢測管，加入400 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，每個樣品臨上機前加入1 μL PI (50 μg/mL)，2 min后迅速檢測；同時以不加Annexin V-FITC 及PI 的一管作為陰性對照。

1.3.4 ELISA檢測細(xì)胞上清中LDH、MDA和SOD含量 根據(jù)ELISA檢測試劑盒說明書測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的LDH、MDA 和SOD 含量。

1.3.5 Western-blot法檢測TLR4 表達(dá) 收集細(xì)胞，RIPA裂解細(xì)胞，BCA蛋白定量試劑盒定量，統(tǒng)一濃度至100 μg。每孔上樣20 μg，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜，加入兔抗鼠TLR4 抗體(1∶500)，4 ℃冰箱孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG(1:5 000) 37 ℃ 孵育1 h，漂洗后于ECL成像系統(tǒng)中發(fā)光顯影，拍照。β-actin做內(nèi)參。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理對心肌細(xì)胞增殖活力的影響 與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組、高糖組、缺氧/復(fù)氧+高糖組CCK8細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.05)，而在加入RES后，缺氧/復(fù)氧+RES組、缺氧/復(fù)氧+高糖+RES組CCK8細(xì)胞增殖能力與缺氧/復(fù)氧組、高糖組及缺氧/復(fù)氧+高糖組比較有明顯提高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組CCK8細(xì)胞增殖結(jié)果(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+高糖組比較，2)P<0.05

2.2 不同處理對心肌細(xì)胞凋亡的影響 與對照組比較，缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+高糖組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。加入白藜蘆醇后，缺氧/復(fù)氧+RES組、缺氧/復(fù)氧+高糖+RES組細(xì)胞凋亡率較缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+高糖組明顯下降(P<0.05)。高糖組細(xì)胞凋亡率與對照組比較有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡、LDH、MDA和SOD比較(±s)

與對照組比較，1)P<0.05；與缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+高糖組比較，2)P<0.05

2.3 各種處理對上清中LDH、MDA和SOD含量的影響 缺氧/復(fù)氧組、高糖組、缺氧/復(fù)氧+高糖組與對照組比較，LDH、MDA均明顯升高(P<0.05)，SOD明顯下降(P<0.05)；RES處理后，缺氧/復(fù)氧+RES組、缺氧/復(fù)氧+高糖+RES組LDH、MDA均較缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+高糖組明顯下降(P<0.05)，SOD較缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+高糖組明顯升高(P<0.05)。詳見表2。

2.4 TLR4蛋白的表達(dá)(見圖1) 缺氧/復(fù)氧組、高糖組及缺氧/復(fù)氧+高糖組心肌細(xì)胞的TLR4蛋白表達(dá)量較對照組明顯升高，而經(jīng)過RES處理后，缺氧/復(fù)氧+RES組、缺氧/復(fù)氧+高糖+RES組TLR4蛋白表達(dá)量較缺氧/復(fù)氧組及缺氧/復(fù)氧+高糖組有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

A：對照組；B：缺氧/復(fù)氧組；C：缺氧/復(fù)氧+RES組；D：高糖組；E：缺氧/復(fù)氧+高糖組；F：缺氧/復(fù)氧+高糖+RES組

圖1各組TLR4蛋白的表達(dá)

3 討 論

心肌缺血再灌注損傷是心肌在缺血基礎(chǔ)上恢復(fù)血流再灌注后，引起細(xì)胞功能代謝障礙和結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象。糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性代謝性疾病。代謝紊亂、心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、微血管病變、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、線粒體結(jié)構(gòu)功能改變等都參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程[9]。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，具有細(xì)胞毒作用，可加劇細(xì)胞膜的損傷。LDH存在于心肌細(xì)胞的胞漿中，是反映細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志物之一。SOD是機體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組及缺氧/復(fù)氧+高糖組LDH、MDA及細(xì)胞凋亡率升高，SOD降低，心肌細(xì)胞增殖受到抑制；高糖組細(xì)胞凋亡率無明顯變化，LDH、MDA明顯升高，SOD明顯降低，心肌細(xì)胞增殖受到抑制。實驗證明，心肌缺血再灌注可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡、抑制心肌細(xì)胞增殖，而高糖處理通過氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯抑制心肌細(xì)胞增殖，但心肌細(xì)胞凋亡不明顯?？紤]高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷是一種慢性過程，心肌細(xì)胞損傷的程度及機制可能與高糖處理的濃度及時間有關(guān)。

越來越多的研究表明，炎癥反應(yīng)在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[10]。而 TLRs能促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)[11]。TLR4是TLRs 家族的一員，其在識別脂多糖及介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用。TLR4 在部分心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中起到的作用也成了當(dāng)前的研究熱點。有文獻(xiàn)報道心臟TLR4的轉(zhuǎn)錄或翻譯水平在壓力超負(fù)荷或高血壓所致心臟重構(gòu)[12]，缺血再灌注或心肌梗死后心臟重構(gòu)[13]以及糖尿病心臟重構(gòu)時增多[14]。本研究結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧處理組和高糖處理組與對照組相比TLR4表達(dá)均明顯升高，證實了TLR4通路可能參與了糖尿病心肌細(xì)胞缺血再灌注的損傷過程。

白藜蘆醇具有抗氧化、螯合自由基及抗脂質(zhì)過氧化等生理藥理學(xué)作用，能預(yù)防及治療心臟病、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病。有研究表明，白藜蘆醇對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞有保護(hù)作用[7-8]。另有研究表明，白藜蘆醇可通過負(fù)向調(diào)控TLR4信號通路減輕高糖環(huán)境下牙齦上皮細(xì)胞炎癥因子的分泌[15]。本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇處理組與缺氧/復(fù)氧和高糖處理組相比，TLR4表達(dá)有一定程度下降，但作用有限。其原因可能與白藜蘆醇處理的濃度和時間有關(guān)。另外推測TLR4信號通路也可能只是RES對糖尿病心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷保護(hù)作用的機制之一。

總之，缺氧/復(fù)氧和高糖均可通過TLR4表達(dá)增加在不同程度上促進(jìn)心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而加速心肌細(xì)胞凋亡，抑制心肌細(xì)胞增殖。這一作用可能參與了心肌缺血再灌注損傷和糖尿病心肌病的發(fā)病機制。白藜蘆醇可能通過降低TLR4表達(dá)對糖尿病心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，但具體應(yīng)用的濃度及時間尚待進(jìn)一步探討。