巨噬細胞極化及IL-6、IL-10對COPD大鼠肺血管重塑的作用機制研究

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種可逆的以進行性氣流受限和肺實質(zhì)的破壞為特征的慢性炎癥性疾病。到2020慢性阻塞性肺疾病將成為全球第三大死因[1]，并將成為第五大致殘病因[2]。慢性缺氧、高碳酸血癥和酸中毒可通過引起COPD病人肺血管重塑的廣泛收縮導致肺動脈高壓。慢性炎癥刺激還可導致血管內(nèi)皮和平滑肌增生以及肺血管結(jié)構(gòu)變化，例如狹窄、閉塞和纖維化導致進一步的肺血管重塑。在COPD晚期，最常見的心血管并發(fā)癥是肺動脈高壓，進一步導致慢性肺心病、右心衰竭，甚至全心衰竭。最近，一些研究表明肺血管重塑和肺動脈高壓是COPD病人引發(fā)肺心病的最關(guān)鍵因素[3-4]。因此，早期COPD肺動脈高壓和肺血管重塑的緩解可以延緩心血管并發(fā)癥的發(fā)生，但用于治療由COPD誘導的肺動脈高壓的靶向藥物很少。

目前為止，COPD的發(fā)病機制尚不清楚。已知吸煙、遺傳因素、呼吸道感染和蛋白酶失衡與COPD的發(fā)病機制密切相關(guān)。吸入氣體或物質(zhì)會引起肺部的氧化應激，破壞蛋白酶和抗蛋白酶之間的平衡，最終導致炎癥，這是COPD發(fā)病機制中最重要的因素之一。在呼吸道內(nèi)，慢性暴露于刺激物，特別是香煙的刺激會激活炎性細胞同時激活肺泡巨噬細胞[2]?；罨木奘杉毎诜挝h(huán)境中釋放炎性細胞因子和趨化因子，誘導肺部慢性炎癥，黏液增多，最終導致氣道重塑和阻塞，造成肺泡和支氣管損傷形成肺氣腫[3，5-6]。巨噬細胞接受炎癥因子刺激逐漸極化為經(jīng)典活化巨噬細胞(M1)和選擇性活化巨噬細胞(M2)。其中M1高表達誘導型一氧化氮合酶(iNOS)[4]，M2高表達甘露糖受體(CD206)[7]。隨著COPD病程嚴重程度的增加，M1 和M2 的比例逐漸增加[8-9]。Lu 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肺氣腫小鼠模型CD68+氣道巨噬細胞表達數(shù)量增加，這種巨噬細胞沒有遵循經(jīng)典的M1/M2 分型?？梢娋奘杉毎砻婵乖淖兓cCOPD疾病的嚴重程度密切相關(guān)，并且巨噬細胞的主要功能之一是趨化因子的分泌，這一功能直接影響了炎癥因子的分泌[11]。故可通過觀察香煙暴露制作的COPD大鼠肺組織的形態(tài)變化以及相關(guān)抗原、炎性因子的表達變化，探討巨噬細胞在COPD肺血管重塑和肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制，為肺源性心臟病提供新的研究策略。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級雄性SD大鼠24只(山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供)，動物合格證編號SXYK(晉)2015-0001，體重(200±20)g，鼠齡10周。將大鼠隨機分為對照組、COPD組，每組12只。建立COPD 大鼠模型，每日將大鼠置于自制染毒箱內(nèi)，暴露于16支香煙中2次(對照組大鼠也置于染毒箱內(nèi)做偽暴露)，每次30 min，2次之間相隔不少于4 h；開始燃燒8支香煙，隨后每次4支香煙，每支香煙燃燒約12 min，換煙間歇3 min。COPD組吸煙3個月。

1.2 實驗試劑及儀器 芙蓉牌香煙(湖南中煙工業(yè)有限責任公司，每支含尼古丁1.0 mg、焦油12 mg)；iNOS(ab15323)、CD206(ab64693)、CD68(ab955)購自Abcam(美國)；抗β-actin抗體、總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購自武漢博士德生物公司；免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗、DAB 顯色劑購自北京中杉金橋生物公司；Western Blot化學發(fā)光劑購自江蘇南通柯侎克生物科技公司；蛋白電泳系統(tǒng)和ChemiDoc XRS+凝膠成像儀購自Bio-Rad；Lionheart FX 智能活細胞成像分析系統(tǒng)購自美國BioTek；ASP6025型脫水機購自德國Leica；5235 型石蠟包埋機購自日本Sakura；CP225D電子分析天平購自德國Sartorius；Scope A1型顯微成像系統(tǒng)購自德國ZISS；BD368498 SSTII分離膠促凝管；ELISA試劑盒購自E-EL-R0015c[白介素-6(IL-6)，Elabscience]；E-EL-R0016c[白介素-10(IL-10)，Elabscience]。

1.3 方法

1.3.1 組織標本的留取 將對照組和COPD組麻醉后生理鹽水灌流處死，將氣管與雙肺暴露，將左肺取出，OCT冰凍切片包埋劑包埋，冰凍切片后，4%多聚甲醛[含0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)]中固定，常規(guī)石蠟包埋。將右肺取出置于液氮中速凍，用于Western Blot檢測。

1.3.2 肺組織蘇木精-伊紅(HE)染色 4%多聚甲醛灌流固定肺組織，再常規(guī)浸泡于此固定液中72 h，石蠟包埋。切成6 μm厚度的切片。烤片后，脫蠟、水化，蘇木精染色5 min，鹽酸酒精分化數(shù)秒，氨水浸泡15 min，伊紅染色2 min，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。

1.3.3 肺組織免疫組化染色 取石蠟包塊切片，厚度5 μm，二甲苯、乙醇脫蠟至水，用3%H2O2封閉10 min，高壓抗原修復2.5 min，冷卻至室溫后滴加封閉液。兔抗iNOS、兔抗CD206用抗體稀釋液稀釋(1∶250)，4 ℃過夜。滴加相應二抗，DAB 顯色，陽性結(jié)果為棕黃色。正置顯微鏡拍照，Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析。

1.3.4 肺組織免疫熒光共染 取冰凍組織切片，厚度5 μm，丙酮固定10 min，將切片置于0.1%Triton X-100溶液中10 min破膜，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3次；將切片置于濕盒中，滴加5%羊血清封閉液室溫孵育30 min，去血清；分別滴加一抗：小鼠抗CD68、兔抗iNOS、兔抗CD206；4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次10 min；滴加熒光二抗：山羊抗小鼠FITC、山羊抗兔RBIC，室溫放置1.5 h；PBS洗3次，每次10 min；DAPI工作液滴加于切片上，染色10 min；PBS 清洗10 min×3次，熒光封片劑封片，Lionheart FX智能活細胞成像分析系統(tǒng)獲取圖像。

1.3.5 Western Blot實驗 于液氮中取出大鼠肺組織，用RIPA(P0013B，碧云天)提取大鼠肺組織總蛋白質(zhì)，制備成50 μL蛋白上樣緩沖液(1 μg/μL)用于Western印跡。將蛋白質(zhì)樣品進行變性(95 ℃ 5 min)處理，制成待測樣本。用10%伯樂免染膠分離不同分子量大小的蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜檢測。膜在5%脫脂牛奶中封閉，兔抗iNOS、CD206按1∶500稀釋，β-actin按1∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜，二抗1∶7 000稀釋，室溫孵育2 h。使用ChemiDoc XRS+凝膠成像儀成像并進行半定量分析。

1.3.6 ELISA實驗 實驗大鼠腹腔注射7.5%的水合氯醛(1 mL/kg)進行麻醉。將大鼠的四肢和頭部按仰臥姿勢固定，使用 1 mL注射器進行心臟采血，靜置于促凝管中30 min 后，1 500 r/min、4 ℃離心 10 min，取上清液液氮保存。

在各孔中加入標準品和樣品各100 μL，37 ℃孵育90 min；倒去孔內(nèi)液體，加入100 μL 生物素化抗體工作液，37 ℃孵育60 min；洗滌3次；加入100 μL酶結(jié)合物工作液，37 ℃孵育30 min；洗滌5次；加入90 μL底物溶液，37 ℃孵育15 min；加入50 μL終止液，立即在450 nm波長處測量OD值。建立標準曲線，進行計算。

2 結(jié) 果

2.1 COPD大鼠肺組織病理變化 與對照組相比，COPD組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管肺內(nèi)出現(xiàn)以淋巴細胞為主的炎癥細胞浸潤，支氣管壁杯狀細胞數(shù)目增多，腺體增生肥大，部分肺泡出現(xiàn)破裂。詳見圖1。

2.2 大鼠肺組織中巨噬細胞M1、M2型極化 免疫熒光顯示COPD組大鼠肺組織中M1(CD68+iNOS+)、M2(CD68+CD206+)型巨噬細胞數(shù)量較對照組增加。通過對肺組織免疫組化的灰度值分析，COPD組大鼠M1型及M2型巨噬細胞較對照組明顯升高(P<0.05)。詳見圖2～圖4。

2.3 大鼠肺組織中M1、M2型巨噬細胞相關(guān)蛋白表達變化 Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，COPD組大鼠iNOS和CD206蛋白水平明顯升高(P<0.05)。詳見圖5。

2.4 大鼠血液中炎性因子IL-6、IL-10表達變化 ELISA結(jié)果顯示，與對照組相比，COPD組IL-6含量顯著升高(P<0.05)，IL-10含量則顯著下降(P<0.05)。詳見圖6。

圖1 兩組大鼠肺組織HE染色

A圖中藍色熒光標記細胞核，綠色熒光標記CD68抗原，紅色熒光標記iNOS抗原；B圖中藍色熒光標記細胞核，綠色熒光標記CD68抗原，紅色熒光標記CD206抗原

圖2兩組大鼠肺組織免疫熒光共染比較

圖3 兩組大鼠肺組織免疫組化染色結(jié)果

圖4 兩組大鼠肺組織表面抗原iNOS、CD206比較

3 討 論

COPD是由于有毒顆粒或氣體(主要是煙草)在呼吸道內(nèi)造成慢性炎癥增加的一類以氣流受限為特征的疾病。最近幾項研究表明，肺動脈高壓和肺血管重塑是COPD發(fā)展成肺源性心臟病最重要和最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[12]。因此，控制肺部血管重塑和肺動脈高壓誘導COPD對于延緩其心血管并發(fā)癥很重要。

既往研究表明，缺氧、炎癥和其他刺激可以導致支氣管和肺血管的損傷和修復過程一次又一次地發(fā)生，最終將導致肺血管重塑及肺源性心臟病[13]。

在COPD 與氣道和肺實質(zhì)的慢性炎癥中，香煙煙霧是激活固有免疫系統(tǒng)細胞的最初觸發(fā)器。對COPD 病人肺組織和氣道分泌物的研究表明，固有免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)的細胞數(shù)量增加和活化發(fā)生了變化[14]。它以肺泡巨噬細胞、中性粒細胞、T 淋巴細胞和來源于循環(huán)的固有淋巴細胞增加為特征[3]。其中巨噬細胞是構(gòu)成固有免疫系統(tǒng)細胞的異質(zhì)群體[15]，可吞噬和殺死攝入的微生物。除此之外，可產(chǎn)生許多促炎抗炎介質(zhì)和效應分子，因此巨噬細胞在功能上不僅能促進炎癥和組織損傷，也能通過釋放一系列抗炎介質(zhì)以及通過胞吞作用清除凋亡細胞來控制和消除炎癥，修復損傷[16]。研究巨噬細胞以及相關(guān)聯(lián)的炎癥因子對于COPD的研究具有非常重要的作用。

在肺組織中主要有3種巨噬細胞，分別為支氣管巨噬細胞(BM)[17]、間質(zhì)巨噬細胞(IM)和肺泡巨噬細胞(AM)[18]。其中AM被認為是在協(xié)調(diào)與之相關(guān)的炎癥事件中起著關(guān)鍵作用，與COPD的病理生理密切相關(guān)[19-20]。可塑性是AM巨噬細胞的一個明顯特征，可分為兩個亞群，其中M1保護宿主抵御外源微生物，抗腫瘤，產(chǎn)生大量炎癥因子如IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，激活抗微生物防御機制，包括有助于殺死入侵生物體的氧化過程和抗腫瘤等[21]。與M1功能不同，M2呈現(xiàn)出抗炎特征，與碎片清除和組織修復有關(guān)[22]。M2 可產(chǎn)生大量IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)。特點是高表達CD206[7]。香煙等外部刺激氣體會導致COPD病人巨噬細胞極化，M1/M2表面抗原表達增加，炎性因子增多。但也有文獻報道，香煙煙霧使COPD 吸煙者的M1 巨噬細胞相關(guān)基因表達顯著下調(diào)，而不是上調(diào)[8]，有趨向M2表達的趨勢。同樣，有些研究也發(fā)現(xiàn)COPD 病人中，與戒煙者相比，吸煙者的M2 巨噬細胞減少，與COPD 病人戒煙及巨噬細胞抗炎表型的極化有關(guān)[23]。以上結(jié)果表明，吸煙可引起肺部免疫反應的復雜抑制，包括巨噬細胞激活和宿主防御功能的失活以及組織重塑的發(fā)展[24]。在病程的發(fā)展過程中M1/M2型巨噬細胞在COPD中表達增高還是降低是不斷變化的，需要進一步細化研究。香煙煙霧刺激制作的COPD大鼠肺組織經(jīng)過HE染色表明，COPD組大鼠肺氣腫明顯，肺間質(zhì)淋巴細胞、中性粒細胞浸潤明顯，還存在支氣管壁大量淋巴細胞增生、細支氣管管壁平滑肌增生、管壁平滑肌部分斷裂、杯狀細胞增生等病理改變。證實熏煙暴露構(gòu)建肺氣腫大鼠模型形成。在此基礎上，對COPD大鼠的肺組織進行免疫組化實驗，分析可知，iNOS (M1型巨噬細胞表面特征性抗原) 和 CD206(M2型巨噬細胞表面特征性抗原)表達與正常肺組織AM細胞相比顯著升高。免疫熒光實驗表明，CD68的表達也同時升高。Western Blot實驗也證明了這個變化。說明有香煙煙霧刺激的COPD發(fā)展到肺組織損傷、結(jié)構(gòu)改變，炎癥細胞浸潤，支氣管壁杯狀細胞數(shù)目增多這一階段時，巨噬細胞可塑性增強、極化顯著、分型復雜。

圖5 Western Blot檢測大鼠肺組織iNOS、CD206

圖6 兩組大鼠血液中IL-6、IL-10含量比較

與巨噬細胞M1/M2極化抗原表達變化不統(tǒng)一，相應的與此相關(guān)的炎性介質(zhì)表達也不一致。ELISA結(jié)果顯示IL-6在COPD大鼠模型血液中表達更多。這可能與此階段COPD病人T細胞、巨噬細胞以及中性粒細胞的數(shù)量明顯增加、浸潤現(xiàn)象明顯有關(guān)。上述這些可以在支氣管內(nèi)誘導產(chǎn)生釋放多種細胞因子如 IL-6、TNF-α等[25]。與前述不同的是，雖然M2 可產(chǎn)生IL-10，但是ELISA結(jié)果表明，COPD大鼠血液中的IL-10含量顯著低于正常大鼠。這可能是由于IL-10 是一種細胞的抗炎因子，主要由機體的單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生和分泌，屬于如 IL-6、腫瘤壞死因子家族等細胞因子合成的抑制性因子[26]。在此階段，大鼠模型的炎癥因子變化與人群COPD炎癥因子變化趨勢相似，故模型可以在一定程度上模擬人COPD疾病的發(fā)生發(fā)展過程。

綜上所述，在香煙誘導產(chǎn)生的COPD大鼠模型中，肺組織已發(fā)生實質(zhì)性改變，炎癥反應明顯；巨噬細胞可塑性增強，極化現(xiàn)象明顯；可用iNOS、CD206以及CD68作為檢測指標；結(jié)合血液中IL-6升高，IL-10含量減少，可共同為COPD的診斷提供依據(jù)，大量的研究證據(jù)表明，巨噬細胞被募集到受損的血管部位，進一步產(chǎn)生活性氧，分泌炎癥因子，促進血管細胞的免疫激活、增殖和遷移。這種正反饋和相互作用的機制造成惡性循環(huán)，加速炎癥反應隨后的血管重塑以及更嚴重的肺源性心臟病，這些結(jié)果均提示，炎癥反應在巨噬細胞參與COPD疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮著巨大而復雜的作用，兩者相結(jié)合的研究，可以為進一步解釋COPD及并發(fā)癥的發(fā)展機制以及開發(fā)新的治療策略提供依據(jù)。