力學(xué)刺激對(duì)軟骨細(xì)胞Cdc42基因表達(dá)及表型的影響

吳 猛 應(yīng) 俊 馬 旺 沈施耘 李雄峰

軟骨細(xì)胞退變導(dǎo)致軟骨剝脫缺損是骨性關(guān)節(jié)炎常見的表現(xiàn)，對(duì)一些年輕的患者采用軟骨修復(fù)的方式可以恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，延緩關(guān)節(jié)置換的時(shí)間。但目前采用的自體軟骨移植，只能修復(fù)較小范圍的缺損，對(duì)于較大面積的缺損，往往需要進(jìn)行體外擴(kuò)增，目前雖有一些實(shí)驗(yàn)室能進(jìn)行自體軟骨細(xì)胞體外擴(kuò)增后，應(yīng)用于臨床，但價(jià)格昂貴，未能普及。同時(shí)軟骨細(xì)胞在體外傳代過(guò)程去分化不能維持表型穩(wěn)定的現(xiàn)象，是軟骨細(xì)胞體外大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)的瓶頸。在以往的研究中發(fā)現(xiàn)適合的力學(xué)刺激能延緩軟骨細(xì)胞去分化，并使去分化的軟骨細(xì)胞恢復(fù)部分功能，但不能長(zhǎng)久有效的維持，研究中還發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在力學(xué)刺激下細(xì)胞骨架的變化可能和軟骨細(xì)胞表型的維護(hù)有一定的關(guān)系[1,2]。

Cdc42蛋白是細(xì)胞內(nèi)一種具有重要功能的蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞極性的維持及承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N功能，并可能具有調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)及其功能的作用，本研究對(duì)力學(xué)刺激下Cdc42的表達(dá)變化及對(duì)軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定性的影響進(jìn)一步分析，并探討二者之間的關(guān)系。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)試劑和儀器： DMEM高糖培養(yǎng)基，胰酶(美國(guó)Gibico公司)；Ⅱ型膠原酶(美國(guó)CalBioche公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibico公司)；Ⅰ型膠原鼠抗單克隆抗體(美國(guó)CalBioche公司)；Ⅱ型膠原鼠抗人單克隆抗體(美國(guó)CalBioche公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)；TRIZOL(美國(guó)Gibico公司)；Go-Taq?qPCR Master Mix(美國(guó)Promega公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma 311公司)；倒置相差顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；PCR儀(德國(guó)Eppendorf AG公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)；移液器(德國(guó)Eppendorf AG公司)；Flexcell?FX-5000TMTension System購(gòu)自美國(guó)。PCR引物序列(上海生工Sangon Biotech公司)。

表1 PCR引物序列

2.軟骨細(xì)胞的獲取:取健康的2周齡SD大鼠12只，體重0.10～0.15kg(浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。苯巴比妥鈉腹腔麻醉后處死，消毒后無(wú)菌分離髖關(guān)節(jié)、用鑷子取下大鼠股骨頭軟骨帽。將軟骨在PBS的培養(yǎng)皿中反復(fù)漂洗數(shù)次后剪碎成1mm左右的軟骨塊，再用含青鏈霉素的PBS漂洗3次。加入適量0.25%胰酶，37℃消化大約1h后終止，最后加入0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃消化4～6h，在倒置相差顯微鏡下觀察到有較多游離的軟骨細(xì)胞后，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞反復(fù)吹打后濾網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，2500r/min，離心5min,棄上清液，加入PBS制成細(xì)胞懸液，0.25%臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞大于90%即傳代培養(yǎng)。將原代軟骨細(xì)胞分別以4×105/cm3密度接種在25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底后用0.25%胰酶消化1∶2傳代培養(yǎng)。然后樣品在0.5%的瓊脂，10V/cm電泳45～60min。成像系統(tǒng)成像分析，攝片記錄。

3.P0～P3代軟骨細(xì)胞RT-PCR表型的鑒定:將培養(yǎng)的P0、P1、P2、P3代軟骨細(xì)胞，細(xì)胞用0.25%胰酶消化，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞量后加入1ml Trizol提取細(xì)胞總RNA。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 5μl，上下游引物各1μl，cDNA模版1μl，10mmol/L dNTP1μl，ExTaq DNA聚合酶0.5μl，加入水至反應(yīng)體系達(dá)50μl。反應(yīng)條件為：上機(jī)94℃ 2min，55℃ 1min，72℃ 2min為第一步1個(gè)循環(huán) 94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 1min，第二步35個(gè)循環(huán)72℃ 10min，4℃ 5min冷卻后電泳。β-actin隨目的基因的條件而擴(kuò)增,PCR引物序列詳見表1。

4.細(xì)胞牽拉裝置Flexcell?FX-5000TMTension System工作的原理以及力學(xué)刺激的大小、頻率和時(shí)間:Flexcell?FX-5000TMTension System利用橡膠密封墊在細(xì)胞培養(yǎng)板基膜與基座之間形成封閉腔，把此密封腔放入CO2培養(yǎng)箱中，然后使用活塞形成負(fù)壓，進(jìn)而拉伸培養(yǎng)板底部彈性硅膠膜發(fā)生形變，使貼壁細(xì)胞受到拉伸而發(fā)生形變而產(chǎn)生效應(yīng)，壓力大小可以通過(guò)計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)調(diào)節(jié)來(lái)改變基膜的形變量(圖1、圖2)。

圖1 Flexcell? FX-5000TM Tension System專用培養(yǎng)板和工作狀態(tài)圖

圖2 Flexcell? FX-5000TM Tension System

將第3代軟骨細(xì)胞放入Flexcell?FX-5000TMTension System專用細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)板孔時(shí)，更換培養(yǎng)基立即將細(xì)胞板放置在Flexcell?FX-5000TMTension System加載裝置上，給以形變幅度10%，頻率0.5Hz的力學(xué)刺激。軟骨細(xì)胞按刺激時(shí)間分組，分別給以0、3、6、9、12h的力學(xué)刺激，然后靜置6h后進(jìn)一步做測(cè)試分析。

5.軟骨細(xì)胞總RNA的提取和體外擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光定量分析:軟骨細(xì)胞在力學(xué)刺激后，細(xì)胞用0.25%胰酶消化，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞量后加入1ml Trizol提取細(xì)胞總RNA。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 5μl，上下游引物各1μl，cDNA模版1μl，10mmol/L dNTP1μl，ExTaq DNA聚合酶0.5μl，加入水至反應(yīng)體系達(dá)50μl。反應(yīng)條件為：上機(jī)94℃ 2min，55℃ 1min，72℃ 2min為第一步1個(gè)循環(huán) 94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 1min，第二步35個(gè)循環(huán)72℃ 10min，4℃ 5min冷卻后電泳。β-actin隨目的基因的條件而擴(kuò)增,PCR引物序列詳見表1。在RT-PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增，以樣品和內(nèi)參的比值代表相應(yīng)基因表達(dá)水平的變化。

6.軟骨細(xì)胞的Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化檢測(cè):力學(xué)刺激后的軟骨細(xì)胞，用4%多聚甲醛(PBS配置)室溫下固定10min,PBS洗2次，每次5min，3%的雙氧水處理10min，正常山羊血清封閉15min，滴加Ⅰ、Ⅱ型膠原(1∶100)一抗，4℃孵育過(guò)夜，室溫下復(fù)溫，PBS洗3次，每次2min，然后滴加二抗，DBA顯色，蘇木素套染后封片觀察?？瞻捉M采用PBS代替一抗，其余操作步驟相同。

7.軟骨細(xì)胞受到力學(xué)刺激后增殖能力的檢測(cè):將受到不同時(shí)間力學(xué)刺激的軟骨細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后細(xì)胞5×104/ml分別接種于5塊96孔培養(yǎng)板中，每塊設(shè)6個(gè)復(fù)孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。加入5g/L的MTT液 20微升/孔，孵育4h后，棄去上清液后，加DMSO 200微升/孔，振蕩10min后在酶標(biāo)儀上測(cè)吸光度(A)值，波長(zhǎng)為490nm。取A值作為結(jié)果，在Excel表中繪制柱圖，來(lái)分析軟骨細(xì)胞的增殖情況。

結(jié) 果

1.軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)觀察和鑒定:消化后大部分軟骨塊消失消化液內(nèi)出現(xiàn)大量折光較強(qiáng)小圓形細(xì)胞，表明軟骨消化成功。軟骨細(xì)胞開始培養(yǎng)后10～12h開始貼壁，24～36h完成貼壁。其外形為大多為圓形、多邊形，呈明顯的鋪路石狀外觀或形成軟骨結(jié)節(jié)(圖3)。傳代后的細(xì)胞貼壁變快，3～5天即可鋪滿培養(yǎng)瓶，并有出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)現(xiàn)象。軟骨細(xì)胞可以分泌大量細(xì)胞基質(zhì)，且基質(zhì)沉積在細(xì)胞周圍將軟骨細(xì)胞互相連接起來(lái)，一般在7～10天即可在瓶底形成一層肉眼可見的膜狀組織，在細(xì)胞消化吹打時(shí)明顯可見。軟骨細(xì)胞在傳代過(guò)程和給以壓力后，其形態(tài)學(xué)變化不明顯。本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色分析軟骨細(xì)胞表型的表達(dá)，見軟骨細(xì)胞在P0～P3Ⅰ型膠原有微弱的表達(dá)，并有增強(qiáng)的趨勢(shì)，而Ⅱ型膠原表達(dá)早P0和P1比較強(qiáng)，傳代后有減弱的趨勢(shì)， Aggrecan表達(dá)情況和Ⅱ型膠原的表達(dá)相似(圖4)。P0代軟骨細(xì)胞的Ⅰ型、Ⅱ型膠原的免疫組織化學(xué)染色可見Ⅱ型膠原有較強(qiáng)的表達(dá)(圖5)，而Ⅰ型膠原的表達(dá)比較弱(圖6)。

圖3 原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng)后形成軟骨結(jié)節(jié)(×200)軟骨細(xì)胞一般呈方形多邊形，立體感強(qiáng)，有很強(qiáng)的折光性

圖4 P0～P3代軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原、Aggrecan、Ⅰ型膠原的表達(dá)

圖5 原代軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原免疫組化可見大量陽(yáng)性細(xì)胞，胞質(zhì)深染

圖6 原代軟骨細(xì)胞Ⅰ型膠原免疫組化可見少量陽(yáng)性細(xì)胞，胞質(zhì)染色淺

2.CDC-42 Ⅰ型膠原，Ⅱ型膠原和Aggrecan qRT-PCR結(jié)果：Cdc-42在力學(xué)刺激9h時(shí)達(dá)到高峰(圖7)，其表達(dá)和0、3、6和12h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。軟骨細(xì)胞Ⅰ型膠原在受到力學(xué)刺激0、3、6h未見明顯的變化，在9h后明顯升高，12h有下降，相對(duì)0、3、6h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Ⅱ型膠原和Aggrecan的RT-PCR的結(jié)果都在9h時(shí)達(dá)到一個(gè)峰值，然后出現(xiàn)下降，相對(duì)0、3、6h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果顯示Cdc-42的變化趨勢(shì)和Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原和Aggrecan的變化趨勢(shì)基本一致(圖8～圖10)。

圖7 Cdc42在受到力學(xué)刺激后的變化與9h比較，#P<0.05；與12h比較，*P<0.05

圖8 Ⅰ型膠原受力學(xué)刺激后的變化與9h比較，#P<0.05；與12h比較，*P<0.05

圖9 Ⅱ型膠原受力學(xué)刺激后的變化與9h比較，#P<0.05；與12h比較，*P<0.05

圖10 Aggrecan 受力學(xué)刺激后的變化與3h比較，*P<0.05，與0h比較，#P<0.05;與6h比較，△P<0.05

3.軟骨細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化：軟骨細(xì)胞和Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫組化表明軟骨細(xì)胞在力學(xué)刺激的過(guò)程中，Ⅰ型膠原表達(dá)和Ⅱ型膠原在開始的0、3、6h表達(dá)較低，在9h表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，胞質(zhì)染色加深。詳見圖11、圖12。

圖11 力學(xué)刺激Ⅰ型膠原的免疫組化(×200)A.0h未受到力學(xué)刺激陽(yáng)性表達(dá)情況；B.受到力學(xué)刺激9h時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況

圖12 力學(xué)刺激Ⅱ型膠原的免疫組化(×200)A.0h未受到力學(xué)刺激陽(yáng)性表達(dá)情況；B.受到力學(xué)刺激9h時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況

在給予力學(xué)刺激，通過(guò)MTT法對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在各個(gè)時(shí)間段都出現(xiàn)了良好的增殖能力，軟骨細(xì)胞在6h和9h時(shí)出現(xiàn)了較好的增殖能力，但在軟骨細(xì)胞表型表達(dá)最高的9h時(shí)之前的6h時(shí)就出現(xiàn)較強(qiáng)的增殖能力，推測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖能力在力學(xué)刺激后先出現(xiàn)增殖能力的增強(qiáng)后出現(xiàn)了表型的高表達(dá)(圖13)。

圖13 軟骨細(xì)胞在力學(xué)刺激后增殖能力的檢測(cè)與6h比較，*P<0.05；與9h比較，#P<0.05

討 論

關(guān)節(jié)疾病的根本原因就是軟骨退變和缺損，隨著體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，目前年幼年老的關(guān)節(jié)軟骨都可在體外培養(yǎng)出軟骨細(xì)胞，引起人們嘗試用自體軟骨細(xì)胞培養(yǎng)增殖修復(fù)軟骨缺損并達(dá)到完全具有生理意義上的功能恢復(fù)[3]。但通過(guò)自體關(guān)節(jié)軟骨在體內(nèi)可獲取的軟骨非常有限，通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增獲得大量具有表型穩(wěn)定性的軟骨細(xì)胞是軟骨組織工程修復(fù)軟骨缺損的重要基礎(chǔ)，軟骨細(xì)胞在體外進(jìn)行單層貼壁培養(yǎng)的過(guò)程中，不能保持表型的穩(wěn)定，因?yàn)槟壳皩?duì)軟骨細(xì)胞在體外發(fā)生去分化的機(jī)制尚不明確，所以未能進(jìn)行穩(wěn)定的傳代培養(yǎng)而不利于軟骨組織工程軟骨的構(gòu)建和骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制的闡釋[4]。

如何保持軟骨細(xì)胞表型的穩(wěn)定性是研究人員目前一直關(guān)注的課題，在筆者的研究中發(fā)現(xiàn)力學(xué)刺激能延緩軟骨細(xì)胞去分化的過(guò)程，動(dòng)態(tài)的力學(xué)刺激能使去分化的軟骨細(xì)胞恢復(fù)部分功能，但不能長(zhǎng)久有效的維持，并和軟骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架的變化有一定的聯(lián)系[1]。如何維持軟骨細(xì)胞表型的穩(wěn)定、提高軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的擴(kuò)增效率，使有大量的軟骨細(xì)胞應(yīng)用于軟骨組織工程修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨是目前研究的方向之一。但目前的研究還沒(méi)有有效的維持軟骨細(xì)表型穩(wěn)定的方法，即使目前的經(jīng)基因轉(zhuǎn)染永生化的軟骨細(xì)胞系，軟骨細(xì)胞也只能保持外形，在傳代過(guò)程失去分泌Ⅱ型膠原的功能表現(xiàn)為去分化狀態(tài)[5]。

一些激素或細(xì)胞因子被研究發(fā)現(xiàn)，它們?cè)谲浌羌?xì)胞的表型穩(wěn)定性維持上有其一定的作用，并存在一定的相關(guān)性，如雌二醇和IL-β均有抑制正常軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原，但低濃度雌二醇卻能夠?qū)笽L-β的抑制作用[6]。Fibulin-3是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，這種蛋白的過(guò)表達(dá)明顯抑制軟骨細(xì)胞的分化作用，同時(shí)抑制Sox5和Sox6，但對(duì)Sox9的表達(dá)沒(méi)有抑制作用，而Sox9被認(rèn)為可能是軟骨細(xì)胞分化重要物質(zhì)之一[7]。Collins-Racie等[8]發(fā)現(xiàn)目前在已知的48種細(xì)胞核受體中，有近2/3在軟骨細(xì)胞中可測(cè)出其表達(dá)，并且將分別從正常軟骨與骨性關(guān)節(jié)炎軟骨中提取的RNA樣本進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，有23種RNA的表達(dá)存在顯著性差異，這說(shuō)明軟骨細(xì)胞發(fā)生變化和其內(nèi)部基因和蛋白表達(dá)改變存在一定的關(guān)聯(lián)。

目前對(duì)軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)定性的維持的研究，主要有兩個(gè)方面：(1)改變軟骨細(xì)胞外在的生存條件，使用各種力學(xué)刺激包括機(jī)械的、液壓的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)的作用，觀察軟骨細(xì)胞表型的穩(wěn)定和基質(zhì)分泌情況[9]。使用三維載體培養(yǎng)或生物反應(yīng)器對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)均取得了一定的作用，加入一些細(xì)胞因子或化學(xué)物質(zhì)也可以改變軟骨細(xì)胞的生存情況，使軟骨細(xì)胞能相對(duì)穩(wěn)定的分泌Ⅱ型膠原和蛋白聚糖[10]。(2)改變軟骨細(xì)胞內(nèi)在的功能，也能取得一定的作用，雖然基因轉(zhuǎn)染能克服軟骨細(xì)胞反復(fù)復(fù)制后的衰老現(xiàn)象，但也面臨著軟骨細(xì)胞表型不穩(wěn)的難題[11]。在一些基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)中，改變細(xì)胞的功能，使細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞的特征，如IGF-1轉(zhuǎn)染后能使骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和纖維細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原[12, 13]。有研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞表型的穩(wěn)定和糖化蛋白-N-聚糖唾液酸相關(guān)的α-2,6與α-2,3的比例有關(guān)，從而影響軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)的功能[14]。而早期抑制軟骨細(xì)胞人組織蛋白酶K的表達(dá)，可使軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和Aggrecan的分泌能力增加，使軟骨細(xì)胞的表型得以維持?？梢娷浌羌?xì)胞體外去分化的原因可能涉及細(xì)胞自身的因素和外在的生存條件，而軟骨細(xì)胞本身的原因是導(dǎo)致軟骨細(xì)胞在體外去分化的內(nèi)因。因此,防止軟骨細(xì)胞去分化以及維持軟骨細(xì)胞的功能的關(guān)鍵問(wèn)題，就是尋找導(dǎo)致軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)去分化的真正的分子機(jī)制。

Cdc42蛋白是Rho GTP酶家族中的一員，承擔(dān)著細(xì)胞多種生理功能，小分子蛋白GTP酶能調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞骨架的變化而影響其功能[15]。Rho蛋白是一種屬于小G蛋白超家族，大小為21～22000的蛋白，在和GTP綁定時(shí)具有生物活性，而和GDP綁定時(shí)沒(méi)有生物活性，但可以相互轉(zhuǎn)化。而只有和GTP綁定時(shí)，GTP酶才能夠激活下游目標(biāo)，引起細(xì)胞形態(tài)的變化和基因表達(dá)的變化，其中Cdc42激活后能促使細(xì)胞偽足形成細(xì)胞外基質(zhì)黏附功能下降并影響軟骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架的聚合[15]。而一些相關(guān)細(xì)胞因子，IL-1、IL-6、TNF-α等的研究也提示對(duì)軟骨細(xì)胞的表型的維持和軟骨基質(zhì)的代謝有密切的關(guān)聯(lián)[16～19]。

防止軟骨細(xì)胞去分化以及維持軟骨細(xì)胞的功能的關(guān)鍵問(wèn)題，就是尋找導(dǎo)致軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)去分化的真正的分子機(jī)制。軟骨細(xì)胞在力學(xué)刺激下GTP-Cdc42可能會(huì)在保持軟骨細(xì)胞的表型穩(wěn)定性。Kira等[20]研究發(fā)現(xiàn)IL-1α、IL-6、IL-8能抑制Cdc42的活性，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞表型的丟失。而細(xì)胞骨架actin的變化可以影響Cdc42的水平，在使用放線菌-D抑制細(xì)胞骨架actin的聚合后，Cdc42的表達(dá)下調(diào)，從而影響軟骨細(xì)胞表型的表達(dá)[21]。Rho家族蛋白，比如Rac，Rho和Cdc42亞家族，其功能就像分子的開關(guān)通過(guò)轉(zhuǎn)換不活躍的GDP綁定和活躍GTP綁定結(jié)構(gòu)狀態(tài)調(diào)節(jié)一些傳導(dǎo)途徑。Cdc42具有一系列的功能，包括細(xì)胞骨架actin的組織、細(xì)胞的黏附、遷移、增殖和凋亡[22]。特異性Cdc42基因敲除的小鼠在胚胎期無(wú)法成活，其軟骨發(fā)育也存在變薄，增殖區(qū)軟骨細(xì)胞瘦小等特點(diǎn)，同時(shí)影響細(xì)胞骨架actin的重組，使細(xì)胞骨架排列紊亂[23]。Cdc42能決定性的影響出生后長(zhǎng)骨的軟骨發(fā)育，并影響軟骨的骨化[24]。Wang等[25]研究表明Cdc42和骨發(fā)生沒(méi)有關(guān)系但和軟骨的發(fā)生密切相關(guān)，而其中BMP2/Cdc42/Pak/p38/Smad信號(hào)途徑可以是基質(zhì)聚集，TGF-b/Cdc42/Pak/Akt/Sox9信號(hào)途徑有利于軟骨的分化。

本研究發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞在受到力學(xué)刺激后，代表軟骨細(xì)胞的表型穩(wěn)定性的Ⅱ型膠原和Aggrecan表現(xiàn)出和Cdc42變化的一致性，而代表軟骨細(xì)胞失去表型穩(wěn)定性的Ⅰ型膠原表達(dá)也出現(xiàn)了一致性，可能是受到力學(xué)刺激后除了代表軟骨細(xì)胞表型的Ⅱ型膠原和Aggrecan表達(dá)增強(qiáng)，而代表軟骨細(xì)胞去分化的Ⅰ型膠原也出現(xiàn)了強(qiáng)表達(dá)，考慮可能是力學(xué)刺激軟骨細(xì)胞功能激活，導(dǎo)致一些炎性因子釋放和單層培養(yǎng)有關(guān)，石楊等[26]通過(guò)流體剪切力刺激軟骨細(xì)胞的研究也表明在一定條件下可以促使Ⅰ型、Ⅱ型膠原的表達(dá)上調(diào)。動(dòng)態(tài)的力學(xué)刺激可能是通過(guò)刺激細(xì)胞釋放一些細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子IL-1、IL-6在軟骨細(xì)胞受到超過(guò)其生理負(fù)荷的刺激后使Cdc42的表達(dá)下調(diào)而使軟骨細(xì)胞表型的喪失，通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞Cdc42的而使軟骨細(xì)胞保持穩(wěn)定，但這個(gè)穩(wěn)定也有一定的條件，只有適合的力學(xué)刺激才能使軟骨細(xì)胞保持穩(wěn)定的表型，這也是需要進(jìn)一步研究的目標(biāo)。