添加防腐劑的五氯柳胺混懸液抑菌效力的檢測與評(píng)價(jià)

姜興粲　李冰　孫繼超　王瑋瑋　張吉麗　 張繼瑜

摘要：為了比較添加防腐劑的五氯柳胺混懸液與未添加此類防腐劑的五氯柳胺混懸液的抑菌效力，探討其防腐劑添加的合理性及必要性，選取未添加防腐劑和原藥、未添加防腐劑、添加防腐劑的制劑，采用《中華人民共和國藥典》2015版四部1121抑菌效力檢查法，以銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉5種菌株對(duì)其進(jìn)行抑菌效力測定。結(jié)果表明：添加防腐劑的五氯柳胺混懸液均達(dá)到《中華人民共和國藥典》2015版抑菌效力標(biāo)準(zhǔn);不添加防腐劑的未能達(dá)到抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)?？梢娢迓攘坊鞈乙褐蟹栏瘎┑奶砑邮呛侠淼模缓栏瘎┑奈迓攘坊鞈乙嚎赡艽嬖跐撛诘娘L(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：五氯柳胺;混懸液;防腐劑;抑菌劑效力;評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)： S853.74? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2019）03-0143-03

在國外，五氯柳胺是水楊苯胺類抗寄生蟲類藥物，對(duì)吸蟲病具有優(yōu)良的療效，主要用于治療牛羊肝片吸蟲病，同時(shí)對(duì)絳蟲和線蟲均具有良好的治療效果。但在國內(nèi)，五氯柳胺尚無成品制劑上市。本試驗(yàn)對(duì)添加防腐劑（對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯）的五氯柳胺混懸液的抑菌效力進(jìn)行了探究?？诜苿┰谑褂眠^程中容易存在微生物污染問題，《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）允許這類產(chǎn)品添加防腐劑，但是過量的防腐劑存在危害，所以對(duì)防腐劑的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)[1-3]。本試驗(yàn)針對(duì)未添加防腐劑的五氯柳胺（主藥）和添加防腐劑的五氯柳胺混懸劑的抑菌效力進(jìn)行考察，探究其防腐劑添加的合理性。

1 試驗(yàn)樣品、儀器及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1 供試品

五氯柳胺混懸液（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所自制），考察其抑菌效力情況。

1.2 儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)、LDZM-60KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、恒溫振蕩器、優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)、THOMAS細(xì)胞密度計(jì)、比色杯（光徑為10 mm）、KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器、BSA423S-CW天平（sartorius）、燒杯、三角瓶等。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（產(chǎn)品批號(hào)：1073051）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）（產(chǎn)品批號(hào)：1073051）、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（產(chǎn)品批號(hào)：1073191）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（產(chǎn)品批號(hào)：1072401）均來自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果符合中華人民共和國藥典要求;對(duì)羥基苯甲酸甲酯（批號(hào)：20180118）和對(duì)羥基苯甲酸丙酯（批號(hào)：20130830）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，氯化鈉（批號(hào)：L218041910）購自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.4 菌種

大腸埃希菌（E. enteritidis）[CMCC（B）44102]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]菌種均來自中國食品藥品檢定研究院[1-5]。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）四部附錄通則[2]1105中“微生物學(xué)計(jì)數(shù)法”對(duì)五氯柳胺混懸液計(jì)數(shù)方法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)[1]。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，按照抑菌劑效力檢查法（《中華人民共和國藥典》2015年版四部1121抑菌效力檢查法）對(duì)樣品進(jìn)行抑菌劑效力測定[4-11]。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備

參照“《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）四部1121抑菌效力檢查法”的方法進(jìn)行菌液制備[1]。采用適宜方法制成含菌量約為107～108 CFU/mL的菌懸液，備用[9-19]。

2.2 計(jì)數(shù)方法的適用性

2.2.1 平皿法 取供試液，加入小于供試液體積1%的菌懸液，使每1 mL供試液中含菌量不大于100 CFU，混勻后取 1 mL 置直徑90 mm的無菌平皿中，用于細(xì)菌培養(yǎng)的平皿注入20 mL溫度不超過45 ℃的胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，用于真菌培養(yǎng)的平皿注入20 mL溫度不超過45 ℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，按規(guī)定條件培養(yǎng)，計(jì)數(shù)[1，20-22]。

2.2.2 計(jì)數(shù)方法 回收率計(jì)算公式為：回收率=（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)，5種試驗(yàn)菌回收率均高于90%，結(jié)果（表1）表明該方法可用于該供試品試驗(yàn)。

2.3 抑菌效力測定

取供試品轉(zhuǎn)移至帶塞塑料管中，每管50 mL，混勻，作為供試品溶液備用。同法制備5份。分別取菌液制備中的菌懸液（或孢子懸液）0.5 mL接種于上述供試品溶液中，每個(gè)容器接種1種試驗(yàn)菌，混合，使供試品溶液中的試驗(yàn)菌均勻分布[1]。在試驗(yàn)期間，接種的供試品溶液置25 ℃培養(yǎng)箱中避光貯存。根據(jù)《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則1121“抑菌效力檢查法”抑菌劑效力，按口服制劑規(guī)定的間隔時(shí)間，分別從每個(gè)接種過的供試品容器中取供試品1 mL，用09%氯化鈉進(jìn)行10倍倍比稀釋，對(duì)各稀釋級(jí)按相應(yīng)的微生物計(jì)數(shù)方法進(jìn)行操作。根據(jù)各間隔時(shí)間的菌數(shù)lg值相對(duì)于初始菌數(shù)lg值減少程度進(jìn)行評(píng)價(jià)[23-27]。

2.4 抑菌效力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

五氯柳胺混懸液抑菌效力評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)按照《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）四部通則1121“抑菌效力檢查法”中口服制劑的抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。該判斷標(biāo)準(zhǔn)分為A、B 2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，“A”是指應(yīng)達(dá)到的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)，特殊情況下，如抑菌劑可能增加不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，則至少應(yīng)達(dá)到“B”的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)，滿足《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）四部通則中抑菌效力檢查法對(duì)口服制劑和直腸給藥制劑抑菌效力的規(guī)定，與接菌量比較，14 d細(xì)菌數(shù)下降均不小于3lg值，真菌數(shù)下降均不小于1lg值，28 d細(xì)菌和真菌數(shù)對(duì)前一個(gè)測定時(shí)間增加的數(shù)量不超過0.5 lg值[1，25-30]。

2.5 未添加防腐劑和原藥、添加防腐劑的制劑及主藥（未添加防腐劑）的抑菌效力結(jié)果

未添加防腐劑和原藥的五氯柳胺混懸液抑菌效力結(jié)果見表2。添加防腐劑五氯柳胺混懸液制劑抑菌效力結(jié)果見表3。主藥（未添加防腐劑五氯柳胺混懸液）抑菌效力結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 處方分析

主藥五氯柳胺對(duì)革蘭氏陽性菌特別是金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)部分革蘭氏陰性菌也有一定的抑制作用，對(duì)霉菌的抑菌作用較弱。防腐劑（對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯）對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及霉菌都有一定的抑制作用。五氯柳胺與防腐劑配合使用后，具有較為理想的廣譜抗菌作用[12]。

3.2 抑菌效力結(jié)果分析

表2表明未添加防腐劑和原藥的五氯柳胺混懸液在進(jìn)行抑菌效力測試中，細(xì)菌中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌14 d菌數(shù)下降大于2.0lg，但是均達(dá)不到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的要求;真菌中黑曲霉 14 d 菌數(shù)下降大于0.5lg且小于1.0lg，可知其不符合《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。表3表明添加防腐劑的五氯柳胺混懸液制劑在進(jìn)行抑菌效力測試中，細(xì)菌和真菌14d菌數(shù)下降大于3.0lg，28 d未恢復(fù)生長，從測試結(jié)果得出其符合《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。表4數(shù)據(jù)顯示，主藥進(jìn)行抑菌效力測試中，細(xì)菌：14d菌數(shù)下降只有金黃色葡萄球菌大于30lg，且28 d時(shí)未恢復(fù)生長;大腸埃希菌和銅綠假單胞菌 14 d 菌數(shù)下降大于20lg，小于3.0lg， 雖然 28 d 時(shí)未恢復(fù)生長，但未能達(dá)到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的14 d抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。真菌：白色念珠菌和黑曲霉14 d下降均小于1.0lg，未能達(dá)到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)[1]。

3.3 添加防腐劑的必要性

防腐劑可以用于抑制微生物的生長繁殖，防止微生物污染而影響產(chǎn)品質(zhì)量。若藥品制劑不具有足夠的抑菌作用，為了防止藥品制劑在使用中發(fā)生微生物污染，產(chǎn)生危害，在藥品制劑中應(yīng)加入合適的防腐劑，特別是口服液這樣的藥品制劑[12，31]。《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）中抑菌效力檢查法項(xiàng)下規(guī)定，用于存活菌數(shù)測定的方法，其方法適應(yīng)性驗(yàn)證試驗(yàn)菌的回收率不得低于70%。本次測試中不添加防腐劑（對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯）的五氯柳胺混懸液未能達(dá)到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）的抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)。抑菌效力檢查結(jié)果證明，在五氯柳胺混懸液處方中加入防腐劑可達(dá)到《中華人民共和國藥典》2015年版（ChP2015）抑菌效力要求[1]。

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