甘薯近緣野生種馬鞍藤對鹽脅迫的生理生化響應(yīng)特征

霍愷森　成小威　曹清河　唐君　朱國鵬　陳艷麗

摘要：馬鞍藤[Ipomoea pes-caprae （L.） R. Brown]是甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.） Burkill]的近緣野生種之一，自然分布于海南、廣州等沿海灘涂地區(qū)，目前關(guān)于其耐鹽方面的研究較少。分析甘薯近緣野生種馬鞍藤根部和葉片在不同鹽濃度脅迫下生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律，將為其耐鹽基因挖掘和甘薯種質(zhì)創(chuàng)新提供依據(jù)和參考。采用沙培法，通過300、600、900 mmol/L NaCl溶液灌溉模擬鹽脅迫，分別測定葉片和根部在脅迫后0、1、3、5、7 d的脯氨酸、丙二醛、可溶性糖、總蛋白含量及凈光合速率。結(jié)果表明，隨著鹽脅迫時間的延長，根部和葉片中的脯氨酸含量逐漸增加;丙二醛、可溶性糖含量以及凈光合速率在不同濃度鹽處理下均呈先上升后下降的趨勢，并在前3 d內(nèi)達到峰值;而總蛋白含量在根部呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在葉片中則呈持續(xù)上升的趨勢。隨著鹽脅迫濃度的增加，脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量所達到的峰值也隨之增加。研究進一步證實馬鞍藤具有較強的耐鹽性，其根部和葉片可分別通過一系列的生理生化變化抵御鹽脅迫;研究還發(fā)現(xiàn)脯氨酸、丙二醛、可溶性糖、總蛋白含量和凈光合速率可作為馬鞍藤耐鹽脅迫的生理指標(biāo)，其中丙二醛、可溶性糖含量在處理后3 d達到峰值，為下一步轉(zhuǎn)錄組測序取樣時間提供了參考，也為挖掘甘薯近緣種耐鹽基因打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：馬鞍藤;鹽脅迫;生理生化;近緣野生種

中圖分類號：S531.01? 文獻標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2019）03-0086-05

馬鞍藤[Ipomoea pes-caprae （L.） R. Brown]是旋花科（Convolvulaceae）甘薯屬（Ipomoea）植物，又名厚藤、馬六藤、沙藤、海灘牽牛等[1]。它是生長在熱帶、亞熱帶海灘的多年生藤蔓植物，也是沙丘固沙植物之一[2]。由于馬鞍藤能夠正常生長在鹽漬度較高的海灘上，表現(xiàn)出較強的耐鹽能力[3]。土壤鹽漬化是制約全球作物生產(chǎn)的因素之一[4]，作物的耐鹽性逐漸成為鹽堿地區(qū)種植的重要考量因素[5]。我國有2 000萬hm2鹽荒地和667萬hm2鹽漬化土壤，約占可耕地面積的25%[6-7]，因此，對植物適應(yīng)鹽脅迫的能力及其耐鹽機制的研究尤為重要。甘薯為鹽敏感型植物[8]，而馬鞍藤作為耐鹽性較強的甘薯近緣野生種之一，可用其作為甘薯屬耐鹽機制研究模式植物并為栽培甘薯遺傳改良提供相關(guān)基因資源[9-10]。同時，鹽脅迫下植物的生理生化指標(biāo)的變化對于耐鹽作物育種和分子標(biāo)記輔助選擇具有重要意義[11]。在馬鞍藤繁殖研究方面，駝娟認為其匍匐莖存活率與沙埋深度顯著相關(guān)，5 cm左右的半埋匍匐莖存活率最高[12]。馬鞍藤匍匐莖經(jīng)沙埋后生長的不定根可彌補主根水分供應(yīng)的不足[2]。馬鞍藤在10‰～15‰ NaCl條件下水培30 d，鹽脅迫影響不大，植株生長基本正常，所測各項生理指標(biāo)呈現(xiàn)規(guī)律性變化[13]。王志鈔在盆栽條件下使用占烘干土質(zhì)量0%、0.5%、1%、2%、2.5%的 NaCl持續(xù)對馬鞍藤進行鹽處理，半個月后陸續(xù)進行相關(guān)生理指標(biāo)的測定，認為馬鞍藤在1% NaCl處理下生長正常，可適應(yīng)低濃度鹽脅迫環(huán)境，具有較強耐鹽性[14]。除此之外，關(guān)于馬鞍藤在耐鹽方面的相關(guān)報道較少。由于前人研究中所測的時間點較少，取樣時間間隔較長，處理濃度偏低，取樣部位不全面，生理指標(biāo)變化趨勢較為單一，未能充分解析其耐鹽機制并難以參考最佳轉(zhuǎn)錄組取樣時間。因此，本試驗采用300、600、900 mmol/L NaCl的高鹽濃度梯度處理，設(shè)置鹽脅迫后0、1、3、5、7 d 5個時間點，分別測量根部和葉片的脯氨酸（proline，簡稱Pro）、丙二醛（malonaldehyde，簡稱MDA）、可溶性糖、總蛋白含量和凈光合速率的變化。研究馬鞍藤在鹽脅迫下植株體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和膜脂氧化產(chǎn)物等生理指標(biāo)的變化規(guī)律，以期解析馬鞍藤耐鹽生理機制，為耐鹽基因挖掘和轉(zhuǎn)錄組取樣時間提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料的培養(yǎng)、處理和光合速率測定

試驗材料為馬鞍藤，種子于2012年冬季收集于海南三亞海濱，保存于國家種質(zhì)徐州甘薯試管苗庫。于2015年在徐州種質(zhì)資源圃播種成苗，盆栽保存至今。于2017年7月份截取新生枝條15～20 cm在霍格蘭（Hoagland）配方溶液中培養(yǎng)，待莖條生根后沙培3～5周，選取長勢一致的植株進行鹽處理。處理組分別用300、600、900 mmol/L NaCl溶液灌溉，對照組（0 d）使用去離子水澆灌。在處理后的1、3、5、7 d和對照組（0 d），分別取植株根和葉片各1 g，液氮速凍，于-80 ℃保存，用于測量各項生理指標(biāo)，每項指標(biāo)測定5次，取平均值。在處理后的1、3、5、7 d和對照組（0 d），選擇晴朗無風(fēng)天氣，在10：00—11：00測定生長方向由頂端向下數(shù)第3張展開葉的凈光合速率，參照張川紅等的方法[15]，用美國拉哥公司（LI-COR）生產(chǎn)的LI-6400便攜式光合速率測定儀進行測定，重復(fù)測定5次，取平均值。

1.2 生理生化指標(biāo)測定

采用南京建成生物工程研究所試劑盒。利用硫代巴比妥酸（TBA）法進行MDA含量的測定[16]。利用酸性茚三酮法對PRO含量進行測定[17]。通過二奎啉甲酸（BCA）法進行總蛋白含量的測定[18]。利用蒽酮比色法進行可溶性糖含量的測定[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel（Excel 97-2003）進行試驗數(shù)據(jù)處理，利用DPS（experinmental design，statistical analysis and data mining）軟件[20]進行多因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽濃度處理對馬鞍藤MDA含量的影響

由圖1可知，隨著鹽脅迫時間的延長，馬鞍藤根部和葉片MDA含量均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。馬鞍藤根部在600、900 mmol/L NaCl處理下，MDA含量均在處理后3 d達到峰值，900 mmol/L NaCl對照組（0 d）與其他各處理組在0.05水平上存在顯著性差異，并且各處理之間也具有顯著性差異。600 mmol/L NaCl處理對照組（0 d）與處理組于處理后1、7 d在0.05水平差異上并不顯著，但與其他各處理間差異顯著。300 mmol/L NaCl MDA含量在處理后1 d達到最大值，處理 0 d 組與除處理5 d之外的其他各組差異均顯著。馬鞍藤葉片部分在900 mmol/L NaCl處理下MDA含量在處理后3 d達到最大值，而300、600 mmol/L NaCl處理的MDA含量在處理后1 d達到最大值;經(jīng)不同濃度鹽脅迫后，葉片MDA含量在上升過程中的對照組（0 d）與各處理組均達到顯著性差異。說明鹽脅迫導(dǎo)致馬鞍藤葉片及根部的活性氧積累，加速了脂膜過氧化，隨著MDA的大量積累，膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損傷。隨著脅迫時間的延長，MDA含量達到峰值后逐漸降低，膜脂過氧化程度逐漸減小。此外，根部MDA含量在 900 mmol/L NaCl處理下脅迫1、3 d后的增幅分別為13551%和464.64%，600 mmol/L NaCl處理下脅迫1、3 d后的增幅分別為121.15%和318.64%，300 mmol/L NaCl處理下脅迫1 d后的增幅為158.98%;葉片MDA含量在 900 mmol/L NaCl處理下脅迫1、3 d后的增幅分別為10922%和120.46%，在600 mmol/L NaCl處理下脅迫1 d后的增幅為110.74%，而在300 mmol/L NaCl處理下脅迫1 d后的增幅為110.52%。說明在不同濃度鹽脅迫后根部MDA含量變化幅度大于葉片，這可能是由于鹽脅迫直接作用于根部所致。經(jīng)方差分析后多重比較（Duncans法，下同）結(jié)果表明，馬鞍藤植株MDA含量存在顯著差異，且3 d>5 d>1 d>0 d>7 d，表明在脅迫3 d后，馬鞍藤對鹽脅迫的響應(yīng)最大，此時植株的生理代謝旺盛。

2.2 不同鹽濃度處理對馬鞍藤Pro含量的影響

脯氨酸是植物體內(nèi)一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)，測定植物體內(nèi)游離脯氨酸的含量，可以判斷逆境對植物的危害程度和植物對逆境的抵抗力。從圖2可以看出，在不同濃度的鹽脅迫下，馬鞍藤根和葉片脯氨酸含量隨處理時間延長呈遞增趨勢，隨鹽脅迫濃度升高，其脯氨酸含量也逐漸升高。在不同鹽濃度脅迫下，根部對照組（0 d）和各處理組間均有顯著性差異。葉片部分在900 mmol/L NaCl處理0 d和脅迫1 d、 600 mmol/L NaCl 脅迫3 d和5 d差異不顯著，但其他各組間均呈現(xiàn)顯著差異?？梢婑R鞍藤根和葉片中游離脯氨酸含量與鹽脅迫程度呈正相關(guān)，屬于植物對于鹽脅迫適應(yīng)性反應(yīng)的一種。

馬鞍藤可通過調(diào)節(jié)自身根部和葉片的脯氨酸含量，進而調(diào)節(jié)滲透壓并對鹽脅迫作出響應(yīng)。馬鞍藤根和葉片中游離脯氨酸含量與鹽脅迫程度呈正相關(guān)，屬于植物對于鹽脅迫適應(yīng)性反應(yīng)的一種。葉片對照組（0 d）脯氨酸含量大于根部對照組（0 d），在300 mmol/L NaCl脅迫下葉片中脯氨酸始終高于根部，而在600 mmol/L NaCl脅迫5 d時根部脯氨酸含量開始與葉片含量相近，但在900 mmol/L NaCl鹽脅迫 3 d 開始，根部脯氨酸含量就開始超過葉片。隨著鹽濃度的升高，根部脯氨酸含量增幅明顯大于葉片，說明隨著脅迫濃度的加大，根部增加脯氨酸含量的滲透調(diào)節(jié)能力增強，在減少鹽脅迫帶來的損害中起到更明顯的作用。

2.3 不同鹽濃度處理對馬鞍藤可溶性糖含量的影響

可溶性糖是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在植物逆境脅迫的情況下，可溶性糖含量的增加，對于細胞膜和原生質(zhì)體都具有一定的保護作用，同時還可以起到保護一部分酶類的作用。從圖3可以看出，在鹽處理后，根部和葉片的可溶性糖含量呈先上升后下降的趨勢。根部可溶性糖含量在300 mmol/L NaCl處理下對照組（0 d）與脅迫1、7 d存在顯著差異;在 900、600 mmol/L NaCl處理下，對照組（0 d）與各處理組間均存在顯著差異，其中900 mmol/L NaCl處理下各組之間均存在顯著性差異。葉片可溶性糖含量在 900、300 mmol/L NaCl處理下對照組（0 d）與各處理組間均存在顯著差異，600 mmol/L NaCl對照組（0 d）與脅迫1 d差異不顯著，但與其他各組在0.05水平上差異顯著。說明馬鞍藤可以通過增加可溶性糖含量來維持滲透平衡，同時可增加對細胞膜和原生質(zhì)體的保護。根部 900 mmol/L NaCl處理下脅迫1 d和3 d的增幅分別為152.84%和274.82%，600、300 mmol/L NaCl處理下脅迫1 d的增幅分別為172.14%、147.38%;葉片在900 mmol/L NaCl處理下脅迫1 d和3 d的增幅分別為14770%和221.07%;在 600 mmol/L NaCl處理下脅迫1 d和3 d的增幅分別為104.24%、206.69%;在300 mmol/L NaCl處理下脅迫1 d和3 d的增幅分別為127.07%、18858%。表明葉片部分隨著脅迫程度的加深可溶性糖含量升高速度加快。在600、300 mmol/L NaCl處理下葉片可溶性糖含量變化幅度大于根部，而在NaCl脅迫濃度達到 900 mmol/L 時根部增幅超過葉片。表明葉片在900 mmol/L NaCl處理下對可溶性糖的調(diào)節(jié)可能達到了極限，在更極端的脅迫條件下，根部會對鹽脅迫作出進一步的響應(yīng)。經(jīng)方差分析多重比較結(jié)果表明，馬鞍藤植株可溶性糖含量在不同處理時間存在顯著差異：3 d>5 d>1 d>0 d>7 d，表明在脅迫3 d時，馬鞍藤通過調(diào)節(jié)可溶性糖含量能夠有效地調(diào)節(jié)滲透平衡，對鹽脅迫作出積極響應(yīng)。

2.4 不同鹽濃度處理對馬鞍藤總蛋白含量的影響

從圖4可以看出，在經(jīng)過鹽處理后，根部總蛋白含量升高，在脅迫后3 d達到最大值，總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，而葉片總蛋白含量則呈持續(xù)上升的趨勢。馬鞍藤根部在 900、300 mmol/L NaCl處理下的總蛋白含量對照組（0 d）和其他各處理組均具有顯著性差異，在600 mmol/L NaCl處理下對照組（0 d）與脅迫1、3 d差異不顯著，但與脅迫5、7 d差異顯著;不同鹽濃度下，葉片總蛋白含量對照組（0 d）和各處理組均具有顯著性差異。說明隨著脅迫程度的加深，馬鞍藤通過增加總蛋白含量調(diào)節(jié)自身滲透平衡，對鹽脅迫作出響應(yīng);但根部和葉片的變化趨勢不同，說明根部和葉片的耐鹽生理機制存在差異，根葉通過不同的耐鹽生理機制相互補充，相互協(xié)調(diào)共同應(yīng)對鹽脅迫。在使用不同濃度的鹽脅迫后，隨著鹽濃度的增加，總蛋白含量也在一定范圍內(nèi)增加;但根部在 300 mmol/L NaCl鹽脅迫3 d時，總蛋白含量會高于 600 mmol/L NaCl，并且脅迫3 d的含量超過了900 mmol/L NaCl，葉片300 mmol/L NaCl脅迫的總蛋白含量從脅迫1 d起始終高于600 、900 mmol/L NaCl，這可能與馬鞍藤本身生長在海灘環(huán)境有關(guān)，其具體機制有待進一步研究。多因素方差分析后的多重比較結(jié)果表明，馬鞍藤植株總蛋白含量存在顯著差異：7 d>3 d>5 d>1 d>0 d，表明在脅迫7 d時，馬鞍藤可通過根部和葉片對鹽脅迫的積極響應(yīng)，有效調(diào)節(jié)滲透平衡。

2.5 不同鹽濃度處理對馬鞍藤凈光合速率的影響

從圖5可以看出，經(jīng)不同濃度鹽處理后，馬鞍藤的葉片凈光合速率增加，在前3 d達到凈光合速率最大值。在900、600、300 mmol/L NaCl處理后7 d內(nèi)，凈光合速率達到的峰值相對于對照組（0 d）分別增加了235.81%、218.87%、17753%，而達到最大光合速率的時間分別為1、2、3 d。由此可見，更高濃度的鹽脅迫可以縮短馬鞍藤達到最大凈光合速率的時間。但經(jīng)過不同濃度的鹽脅迫后，葉片的凈光合速率的變化趨勢相同，說明在經(jīng)過鹽脅迫后，馬鞍藤會通過增加光合速率的方式應(yīng)對鹽脅迫，凈光合速率在達到最大值后下降，可能是由于光合器官受損、鹽脅迫導(dǎo)致氣孔關(guān)閉造成的。在脅迫7 d時，900、600 mmol/L NaCl處理下的凈光合速率為0，而300 mmol/L NaCl處理下馬鞍藤有機物質(zhì)仍在積累。

3 討論

甘薯屬約有600～700個種，甘薯是其中為數(shù)不多的栽培種之一[21]。甘薯的近緣野生種遺傳資源非常豐富，并且甘薯近緣野生種攜帶了大量優(yōu)異基因。本研究發(fā)現(xiàn)馬鞍藤作為甘薯的近緣野生種之一，在300 mmol/L NaCl脅迫后正常生長可持續(xù)至30 d;在900 mmol/L NaCl脅迫后部分葉片萎蔫，仍可存活7 d。由此可見，馬鞍藤具有較強的耐鹽性，這對于甘薯種質(zhì)創(chuàng)新和馬鞍藤耐鹽基因挖掘具有重要作用。

本試驗通過測定馬鞍藤的5項生理指標(biāo)，以期了解馬鞍藤對鹽脅迫的響應(yīng)特征及耐鹽生理機制。已報道MDA含量變化與鹽脅迫相關(guān)[22]，同時丙二醛含量是膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要指標(biāo)之一。與根部相比葉片丙二醛含量變化幅度較小，可見馬鞍藤遭受鹽脅迫傷害后葉片氧化損傷程度較低，這與雷鈞杰等在四翅濱藜上的研究結(jié)果[23]相似。鹽脅迫后期膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)逐漸減少，可能是由于植物自身抗氧化保護機制對活性氧的清除起了作用[24]。

植物在正常條件下，游離Pro的含量較低，但遇到干旱、低溫、鹽堿等逆境時，植物體內(nèi)游離的Pro會大量積累[25-27]。在細胞內(nèi)Pro可作為與酶和其他細胞大分子的相容性較高的滲壓劑，因此Pro可以降低植物組織中的滲透勢[28]。馬鞍藤經(jīng)不同濃度的鹽處理后，根部和葉片中游離的Pro含量持續(xù)增加，表明Pro積累與馬鞍藤的鹽脅迫相關(guān)，并可作為鹽脅迫的應(yīng)激性響應(yīng)指標(biāo)。馬鞍藤在900 mmol/L NaCl脅迫下仍能保持較高含量的游離Pro含量，由此推測馬鞍藤具有較強的滲透調(diào)節(jié)能力是其具有較強耐鹽性的原因之一。馬鞍藤根部和葉片的Pro含量在不同的鹽濃度處理下表現(xiàn)出明顯差異，根部Pro含量比葉片Pro含量變化幅度更大，可見在鹽脅迫后根部Pro調(diào)節(jié)起到更重要的作用，這可能是由于鹽脅迫直接作用于根部所致。這一結(jié)果與甘薯及其近緣植物的干旱脅迫結(jié)果相似[21]，也進一步表明植物體內(nèi)游離的Pro含量可作為植物耐鹽的重要生理指標(biāo)之一。

鹽脅迫下植物可溶性糖的積累量，可以反映植物耐鹽脅迫能力的強弱，與脅迫強度存在一定正相關(guān);對植物體滲透調(diào)節(jié)而言，嚴重鹽脅迫會使植物體滲透調(diào)節(jié)能力喪失[29-30]。在本試驗中，可溶性糖在脅迫初期在根部和葉片中大量積累，以增強細胞滲透調(diào)節(jié)能力?？偟鞍缀靠梢允辜毎３诌m當(dāng)?shù)臐B透勢，在防止細胞脫水的同時可以穩(wěn)定和保護生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能。本試驗中根部總蛋白含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，而葉片中總蛋白含量則持續(xù)上升。葉片與根部不同的變化趨勢，可能與其不同部位的耐鹽生理機制差異有關(guān)，也可能是后期總蛋白含量的持續(xù)上升對Pro等調(diào)節(jié)物質(zhì)的補償，以增強細胞的滲透調(diào)節(jié)能力。凈光合速率作為光合系統(tǒng)功能的直接體現(xiàn)，也是植株光合系統(tǒng)正常與否的指標(biāo)[31]。鹽處理初期凈光合速率明顯上升，可能是由于馬鞍藤原本是鹽生植物。鹽脅迫后期光合速率明顯下降，造成植物光合能力下降的原因主要是光合器官損傷、酶活力下降和抑制物質(zhì)增多等[32-33]，也可能是根系受鹽脅迫產(chǎn)生的化學(xué)信號（如脫落酸（abscisic acid，簡稱ABA）引起氣孔關(guān)閉[34]而使光合速率下降。

綜上所述，利用3種鹽濃度溶液脅迫馬鞍藤植株并對其葉片和根的5項生理生化指標(biāo)進行測定及分析。所測5項生理指標(biāo)具有一定的變化趨勢，其中馬鞍藤的MDA、可溶性糖含量均在脅迫3 d后最高，并由此推薦3 d可作為轉(zhuǎn)錄組取樣時間節(jié)點;而葉片中的總蛋白含量在7 d時最高，這可能與根部和葉片耐鹽生理機制不同相關(guān)。由此可見，馬鞍藤各生理指標(biāo)相互協(xié)調(diào)，積極應(yīng)對鹽脅迫，為其較強的耐鹽性提供了理論支撐。不同部位各生理指標(biāo)的趨勢和變化的差異說明，其根部和葉片的耐鹽生理機制可能存在差異，其具體差異原因有待進一步研究。

4 結(jié)論

馬鞍藤在鹽脅迫下可以迅速和有效地通過自身調(diào)節(jié)來抵御鹽脅迫帶來的影響，具有較強的耐鹽能力;MDA、Pro、可溶性糖、總蛋白含量與凈光合速率等5項指標(biāo)均呈現(xiàn)出規(guī)律性變化，可作為馬鞍藤鹽脅迫的響應(yīng)指標(biāo)，為耐鹽甘薯種質(zhì)資源創(chuàng)新和耐鹽基因挖掘提供了理論依據(jù)，也可為鹽脅迫下的轉(zhuǎn)錄組試驗取樣時間提供參考。

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