• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    紫萼玉簪HvGASA、HvFAD基因的克隆及表達(dá)分析

    2019-08-10 03:46:59莊倩倩陳少鵬劉洪章
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年4期
    關(guān)鍵詞:基因克隆基因表達(dá)抗寒性

    莊倩倩  陳少鵬  劉洪章

    摘要:利用RACE技術(shù)、Genome Walking技術(shù)及PCR技術(shù),從紫萼玉簪中克隆得到長(zhǎng)度分別為336、1 320 bp的GASA基因HvGASA和脂肪酸去飽和酶基因HvFAD的cDNA全長(zhǎng)序列,分別編碼111、399個(gè)氨基酸,其中HvFAD基因所編碼的蛋白為跨膜蛋白。qRT-PCR分析結(jié)果表明,2條基因隨自然地溫的降低均上調(diào)表達(dá),而且在地溫降至3 ℃時(shí)發(fā)生劇烈的表達(dá)量變化,說(shuō)明HvGASA、HvFAD基因與紫萼玉簪的抗寒性具有密切關(guān)系。

    關(guān)鍵詞:紫萼玉簪;HvGASA基因;HvFAD基因;基因克隆;基因表達(dá);抗寒性

    中圖分類號(hào): S682.1+90.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A? 文章編號(hào):1002-1302(2019)04-0055-06

    紫萼玉簪(Hosta ventricosa)又稱紫花玉簪、紫玉簪,為百合科玉簪屬多年生宿根草本植物,在我國(guó)主要分布于東北、華東、西南、廣西等地[1],自然生長(zhǎng)于林下、溪邊。紫萼玉簪花紫色、無(wú)香味,葉卵圓形,有較高的觀賞價(jià)值,作為重要的觀賞植物被廣泛應(yīng)用于園林地被、花境及盆栽。玉簪屬其他植物觀賞性狀豐富,如具有白色花朵、花朵具有香氣等,但這些玉簪屬植物多數(shù)不耐寒,無(wú)法在東北地區(qū)自然越冬,這嚴(yán)重阻礙了玉簪屬植物在東北地區(qū)的應(yīng)用推廣,然而紫萼玉簪具有極耐寒的特性,是唯數(shù)不多的能夠在東北地區(qū)自然越冬的玉簪屬植物之一,故推測(cè)紫萼玉簪具有其他玉簪屬植物所不具備的抗寒相關(guān)基因及抗寒機(jī)理。本研究通過(guò)探究紫萼玉簪中與抗寒功能相關(guān)的基因,為今后摸清紫萼玉簪的抗寒機(jī)理及利用分子育種方法進(jìn)行抗寒玉簪新品種培育提供參考。

    GASA(gibberellic acid-stimulated Arabidopsis)基因家族最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)[2],后來(lái)在很多其他植物中發(fā)現(xiàn)了與其相似的蛋白,如水稻(Oryza sativa)OsGASR1基因和OsGASR2基因[3]、草莓(Fragaria ananassa)GAST1-like基因、矮牽牛(Petunia hybrida)GIP基因[4]等。GASA編碼基因數(shù)量眾多,大多數(shù)成員受赤霉素(GA)調(diào)控[5]。GASA蛋白又稱Snakin蛋白,是一類CRP(cysteine-rich peptides)蛋白。CRP蛋白是植物中富含半胱氨酸的小分子多肽,其在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境反應(yīng)中具有重要的作用[6]。GASA蛋白中富含半胱氨酸,半胱氨酸是形成二硫鍵所必需的,而二硫鍵的形成對(duì)維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的穩(wěn)定具有非常重要的作用。GASA蛋白在低溫、高鹽等非生物脅迫應(yīng)答中具有重要作用,此外也參與多項(xiàng)生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng),如種子萌發(fā)、根的形成、莖的生長(zhǎng)、花和果實(shí)發(fā)育及蟲害、病菌等生物脅迫,在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中亦發(fā)揮重要的調(diào)控作用[7]。

    脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase,F(xiàn)AD)是不飽和脂肪酸合成途徑中重要的酶物質(zhì),F(xiàn)AD基因是油酸合成的關(guān)鍵酶基因。當(dāng)植物處于低溫環(huán)境時(shí),F(xiàn)AD通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪酸不飽和度來(lái)調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性[8],保護(hù)膜結(jié)構(gòu)不受破壞,從而達(dá)到提高植物抗寒性的作用。目前FAD基因在許多植物中被發(fā)現(xiàn)及研究,其中有關(guān)抗寒性研究的植物種類也很多,包括馬齒莧、棉花、橄欖、白蕓豆、馬鈴薯等[9]。此外,不飽和脂肪酸與植物的抗旱[10]、耐鹽[11]、抗重金屬、抗病、細(xì)胞識(shí)別以及組織免疫等方面也密切相關(guān)[12-13]。

    1 材料與方法

    1.1 材料采集與處理

    從2015年9月15日至11月24日,隨著長(zhǎng)春地區(qū)由秋季轉(zhuǎn)入冬季,氣溫及地溫逐漸降低,每隔7 d于當(dāng)日07:00進(jìn)行采樣,每次采集的樣品依次編號(hào)為A~K。每次采樣對(duì)校園內(nèi)同地點(diǎn)種植的紫萼玉簪根系進(jìn)行采集,并測(cè)定實(shí)時(shí)地溫(距離地表10 cm處),記錄當(dāng)天最高及最低氣溫,將根系泥土用去離子水沖洗干凈,吸干表面的水分,液氮速凍后置于 -80 ℃ 冰箱保存,具體采樣的氣候條件見表1。

    1.2 DNA提取、總RNA提取、完整性檢驗(yàn)及反轉(zhuǎn)錄cDNA

    紫萼玉簪根系總DNA提取采用改良CTAB法[14],總RNA提取使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA、RNA的完整性、降解程度及是否存在污染,采用超微量紫外光分光光度計(jì)測(cè)定二者濃度。采用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa公司)將提取的紫萼玉簪根系RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA,制備好的cDNA置于-20 ℃冰箱保存。

    1.3 HvGASA、HvFAD基因的克隆

    筆者所在課題組前期進(jìn)行了紫萼玉簪轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作,建立了以抗寒性為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),測(cè)序材料為紫萼玉簪的根系。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出2條功能注釋與GASA、FAD相關(guān)的差異表達(dá)基因(differentially expressed gene,DEG)進(jìn)行下一步分析,序列在測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中的ID分別為c18557.graph_c0、c60584.graph_c0。在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp比對(duì),發(fā)現(xiàn)c18557.graph_c0蛋白序列與石刁柏(Asparagus officinalis)的AoGASA基因(XP_02027448.1)及大蒜(Allium sativum)AsGASA基因(AEX55233.1)分別具有66%、59%的一致性,故命名為HvGASA基因;c60584.graph_c0蛋白序列與石刁柏的脂肪酸去飽和酶AoFAD(XP_0202441744.1)具有85%的一致性,故命名為HvFAD基因。

    以紫萼玉簪根系cDNA為模板,采用3′RACE及5′ Genome Walking的方法進(jìn)行HvGASA、HvFAD基因ORF全長(zhǎng)克隆,試驗(yàn)具體操作方法詳見3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase(TaKaRa公司)使用說(shuō)明書及Genome Walking Kit(TaKaRa公司)使用說(shuō)明書。使用Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì),并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成及測(cè)序,引物信息見表2。

    1.4 生物信息學(xué)分析

    利用Ex PASy-Prot Param和Ex PASy-Prot Scale在線分析氨基酸序列的疏水性和理化性質(zhì)。通過(guò)Expasy網(wǎng)站(http://www.expasy.org/)將該cDNA序列翻譯為氨基酸序列。通過(guò)NCBI網(wǎng)站的在線BLAST分析工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的BLASTp工具對(duì)核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)庫(kù)檢(比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇NR,替換計(jì)分矩陣選擇BLOSUM62,其他采用默認(rèn)參數(shù)),檢索與該蛋白序列相似度較高的序列。然后選取比對(duì)結(jié)果中E-value較低且Querycover較高的序列,用CLUSTX2進(jìn)行多序列比對(duì)。采用Signal P4.1預(yù)測(cè)其是否具有信號(hào)肽。將多序列比對(duì)結(jié)果輸出為NEXUS格式,用PUAP 4.0和Modeltest 3.7檢驗(yàn)最優(yōu)的氨基酸替換模型,然后在GTR+I+G(廣義時(shí)間可逆)模型下用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹。在NCBI網(wǎng)站使用BLASTp程序進(jìn)行庫(kù)檢,數(shù)據(jù)庫(kù)采用PDB,搜索結(jié)果與目的基因氨基酸序列相似性較高且已知蛋白晶體的序列,并選擇與目的基因相似度較高且分辨率較高的3個(gè)晶體結(jié)構(gòu)作為參考,然后用Modeller 9.1軟件,構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)。用PSORT Ⅱ在線分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析。

    1.5 qRT-PCR表達(dá)量分析

    qRT-PCR使用的引物序列見表2,以報(bào)道的Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因[15],設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)。試驗(yàn)試劑采用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司),儀器使用7300 Fast Real Time PCR System(ABI公司)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 總DNA提取、總RNA提取及檢驗(yàn)

    紫萼玉簪根系總DNA提取凝膠電泳結(jié)果見圖1,D260 nm/D280 nm為1.925,DNA濃度為486 μg/μL。根系總RNA的凝膠電泳結(jié)果見圖2,D260 nm/D280 nm為2.031,RNA濃度為 209 μg/μL。

    2.2 HvGASA、HvFAD基因的克隆

    用3′RACE和5′Genome Walking的方法進(jìn)行HvGASA、HvFAD基因3′末端和5′末端的克隆,PCR凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖3,切膠回收測(cè)序后,利用DNAMAN進(jìn)行全長(zhǎng)序列拼接后,再進(jìn)行Blast序列比對(duì),獲得具有完整ORF框的2條基因序列:HvGASA(336 bp,圖3-a)、HvFAD(1 320 bp,圖3-b)。

    2.3 生物信息學(xué)分析

    2.3.1 HvGASA基因

    2.3.1.1 理化性質(zhì)分析、多序列比對(duì) HvGASA基因的序列全長(zhǎng)為336 bp,編碼的蛋白質(zhì)全長(zhǎng)111個(gè)氨基酸,分子量為27.95 ku,等電點(diǎn)(pI)為5.24。利用推測(cè)的HvGASA氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp搜索,并從其序列比對(duì)結(jié)果中挑選相似性較高的12條GASA蛋白序列,進(jìn)一步與HvGASA進(jìn)行多序列比對(duì),結(jié)果如圖4所示。通過(guò)SMART網(wǎng)站及ExPASy-ProtScale網(wǎng)站對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)GASA蛋白N端1~23個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列(圖4中方框區(qū)域),C末端具有由12個(gè)半胱氨酸殘基組成的高度保守的GASA結(jié)構(gòu)域(圖4中箭頭所指部位),兩者之間是極性氨基酸殘基組成的可變親水區(qū)域,黑色背景區(qū)域?yàn)楸J匦暂^高區(qū)域。

    2.3.1.2 構(gòu)建進(jìn)化樹 利用PUAP 4.0對(duì)13條GASA蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)GASA蛋白可被分為2大類(圖5),其中桐油樹(Jatropha curcas,NP_001295614.1 )、毛果楊(Populus trichocarpa,XP_002307720.1)、蕪菁(Brassica rapa,XP_009112561.1)、巨桉(Eucalyptus grandis,XP_010060208.1)、芝麻(Sesamum indicum,XP_011092868.1)等8條序列聚為一類;HvGASA與石刁柏(Asparagus officinalis,XP_020274408.1)、大蒜(Allium sativum,AEX55233.1)關(guān)系較近,與鐵皮石斛(Dendrobium catenatum,XP_010688394.1)、甜菜(Beta vulgarias,XP_010690459.1)聚為一類。

    2.3.1.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用Modeller 9.1軟件構(gòu)建三維結(jié)構(gòu),構(gòu)建出的HvGASA蛋白三維結(jié)構(gòu)如圖6所示。

    2.3.1.4 亞細(xì)胞定位分析 用PSORTⅡ在線分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析,得到HvGASA蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果為39.1%的可能性在線粒體,30.4%的可能性在細(xì)胞外,17.4%的可能性在細(xì)胞核內(nèi),8.7%的可能性在細(xì)胞漿,4.3%的可能性在囊泡中。

    2.3.2 HvFAD基因

    2.3.2.1 理化性質(zhì)分析、多序列比對(duì) HvFAD基因的序列全長(zhǎng)為1 320 bp,編碼399個(gè)氨基酸,具有3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),說(shuō)明FAD是跨膜蛋白,分子量50.98 ku,等電點(diǎn)(pI)為8.85。利用推測(cè)的HvFAD基因編碼的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp搜索,并從其序列比對(duì)結(jié)果中挑選相似性較高的12條FAD蛋白序列,進(jìn)一步與HvFAD的編碼氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)。多序列比對(duì)結(jié)果如圖7所示,圖中方框標(biāo)識(shí)區(qū)域?yàn)樵摶虻?個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),黑色背景區(qū)域?yàn)楸J匦暂^高區(qū)域。

    2.3.2.2 構(gòu)建進(jìn)化樹 HvFAD基因與石刁柏(Asparagus officinalis,XP_020241744.1)100%同源,與菠蘿(Ananas comosus,XP_020082614.1)、小果野蕉(Musa acuminata,XP_00938546.1)、油棕(Elaeis guineensis,XP_010942103.1)、海棗(Phoenix dactylifera,XP_008799646.1)聚為一類,詳見圖8。

    2.3.2.3 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用Modeller 9.1軟件構(gòu)建三維結(jié)構(gòu),構(gòu)建出的HvFAD蛋白三維結(jié)構(gòu)如圖9所示。

    2.3.2.4 亞細(xì)胞定位分析 用PSORTⅡ在線分析軟件對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析,得到該蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果為55.6%可能性定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),44.4%可能性定位于線粒體。這與報(bào)道中EuFAD3-1(杜仲,Eucommia ulmoides)基因通過(guò)亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)果[16]相似。

    2.4 qRT-PCR分析表達(dá)量

    通過(guò)qRT-PCR試驗(yàn),獲得HvGASA、HvFAD基因在紫萼玉簪入冬自然降溫過(guò)程中的表達(dá)量變化,結(jié)果見圖10。

    2.4.1 HvGASA基因qRT-PCR分析 通過(guò)qRT-PCR試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),紫萼玉簪中GASA基因的表達(dá)量在入秋降溫過(guò)程中有3個(gè)明顯的降溫階段(17.2~11.5、11.5~3、3~-1.0 ℃),HvGASA基因表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),而最后一次降溫中HvGASA基因上調(diào)表達(dá)的幅度明顯大于前2個(gè)階段降溫,說(shuō)明3 ℃低溫對(duì)紫萼玉簪產(chǎn)生了較明顯的脅迫作用,致使HvGASA基因大量表達(dá)以抵御逆境脅迫,而當(dāng)降溫程度減弱甚至稍有回升時(shí),HvGASA基因表達(dá)量又表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)。

    2.4.2 HvFAD基因qRT-PCR分析 紫萼玉簪FAD基因在入秋降溫過(guò)程中有3個(gè)明顯的降溫階段(17.2~11.5、11.5~3、3~-1.0 ℃),HvFAD基因表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),且 11.5~3 ℃的降溫幅度中,HvFAD基因上調(diào)表達(dá)幅度最明顯。

    3 討論

    GASA編碼基因數(shù)量眾多,不同的GASA基因家族成員可以具有相同或相反的功能,甚至同一GASA基因家族成員具有多種生物學(xué)功能。本研究通過(guò)低溫差異背景下進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,經(jīng)Unigene組裝及差異表達(dá)基因分析、基因功能注釋等工作,從測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到HvGASA基因。曾有文獻(xiàn)報(bào)道GASA基因與環(huán)境溫度相關(guān),Ko等研究表明,擬南芥GASA4基因的表達(dá)與溫度有關(guān),研究發(fā)現(xiàn)該基因與玉米(Zea mays)的耐熱基因TTO 6(Thermo-tolerance 6)存在69%的相似性;GASA4基因過(guò)表達(dá)下,轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗熱性顯著增強(qiáng),認(rèn)為可能是GASA4蛋白作為胞外熱擊信號(hào)分子或者作為分子伴侶通過(guò)穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的與熱擊因子HSE(heat shock element)有關(guān)的BiP蛋白(binding protein),從而提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐熱性[17]。張強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn),大馬士革玫瑰(Rosa damascena)的GASA4-like基因與擬南芥(Arabidopsis thaliana)GASA4氨基酸及玉米耐熱基因TTO6氨基酸均有較高的相似性。通過(guò)對(duì)GenBank的Blast分析及基因序列分析發(fā)現(xiàn),大馬士革玫瑰GASA4-like基因與高溫和鹽脅迫下誘導(dǎo)表達(dá)的基因高度同源,其序列中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)MYB、MYC轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)和誘導(dǎo)抗性響應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的W-box,表明GASA4-like的蛋白可能也參與了植物的抗性調(diào)節(jié)過(guò)程[18]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),自然降溫過(guò)程中HvGASA基因會(huì)隨著降溫而發(fā)生上調(diào)表達(dá),且降溫幅度大,表達(dá)量上調(diào)幅度也增加,而當(dāng)溫度略有回升時(shí),HvGASA基因發(fā)生下調(diào)表達(dá),說(shuō)明紫萼玉簪GASA基因與植物抗寒性具有密切的關(guān)系,并成正向相關(guān),而玉簪的GASA基因是否還參與系統(tǒng)發(fā)育等方面的建成,還有待于進(jìn)一步研究。

    植物受低溫脅迫時(shí)引起的受害反應(yīng)主要是由于低溫破壞了細(xì)胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和流動(dòng)性,而脂肪酸是細(xì)胞膜脂的主要成分,適當(dāng)?shù)脑黾又参矬w內(nèi)不飽和脂肪酸的比例,可明顯提高植物的抗寒性。根據(jù)雙鍵的位置和功能等可將不飽和脂肪酸分為ω-3和ω-6 2種類型[19],目前對(duì)ω-3脂肪酸去飽和酶基因研究多集中在FAD3基因,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道該基因已從紫蘇(Perilla frutescens)等植物中成功分離克隆出來(lái),經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證該基因的過(guò)量表達(dá)可顯著提高植物體內(nèi)不飽和脂肪酸的比例,而提高植物的抗寒性[20]。ω-3脂肪去飽和酶屬于膜結(jié)合脫氫酶,有研究表明,擬南芥的脂肪酸脫氫酶基因FAD3和FAD7基因在常溫下可正常表達(dá),而FAD8基因只有在溫度≤20 ℃ 時(shí)才表達(dá)[19]。本試驗(yàn)中HvFAD基因隨自然降溫而發(fā)生上調(diào)表達(dá),原因是FAD基因上調(diào)表達(dá)的結(jié)果是增加了不飽和脂肪酸的含量,從而提高膜脂的流動(dòng)性,最終使得植物的耐凍性得到提高。有研究證明,脂肪酸的代謝和修飾在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或胞質(zhì)中進(jìn)行[21],本研究中對(duì)紫萼玉簪的FAD基因的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果與之相符合。

    通過(guò)上述2條與抗寒相關(guān)基因在不同地溫環(huán)境中表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn),2條基因均在3 ℃附近表現(xiàn)出明顯的表達(dá)量變化,由此可推測(cè)紫萼玉簪根系對(duì)于3 ℃以上低溫環(huán)境不敏感,3 ℃ 以上低溫對(duì)紫萼玉簪根系組織的影響相對(duì)較小,而3 ℃以下的低溫會(huì)明顯影響其正常生理活動(dòng),致使大量抗寒相關(guān)基因迅速發(fā)生表達(dá)量變化,以達(dá)到抵御低溫所帶來(lái)的危害。

    4 結(jié)論

    從紫萼玉簪中克隆得到HvGASA、HvFAD基因的cDNA全長(zhǎng)序列,長(zhǎng)度分別為336、1 320 bp,分別編碼111、399個(gè)氨基酸,其中HvFAD基因所編碼的蛋白為跨膜蛋白。qRT-PCR分析結(jié)果表明,2條基因隨自然地溫的降低均發(fā)生上調(diào)表達(dá),而且在地溫降至3 ℃時(shí)發(fā)生劇烈的表達(dá)量變化,說(shuō)明HvGASA和HvFAD與紫萼玉簪的抗寒性具有密切的關(guān)系。

    參考文獻(xiàn):

    [1]盤 波,丁 濤,寧世江. 廣西元寶山自然保護(hù)區(qū)珍稀野生花卉資源[J]. 中國(guó)野生植物資源,2009,28(6):21-25.

    [2]Herzog M,Dorne A M,Grellet F. GASA,a gibberellin-regulated gene family from Arabidopsis thaliana,related to the tomato GAST1 gene[J]. Plant Molecular Biology,1995,27(4):743-752.

    [3]Furukawa T,Sakaguchi N,Shimada H. Two OsGASR genes,rice GAST homologue genes that are abundant in proliferating tissues,show different expression patterns in developing panicles[J]. Genes & Genetic Systems,2006,81(3):171-180.

    [4]Ben-Nissan G,Lee J Y,Borohov A,et al. GIP,a petunia hybrida GA-induced cysteine-rich protein:a possible role in shoot elongation and transition to flowering[J]. Plant Journal,2004,37(2):229-238.

    [5]Sun S L,Wang H X,Yu H M,et al. GASA14 regulates leaf expansion and abiotic stress resistance by modulating reactive oxygen species accumulation[J]. Journal of Experimental Botany,2013,64(6):1637-1647.

    [6]Wolf S,van der Does D,Ladwig F,et al. A receptor-like protein mediates the response to pectin modification by activating brassinosteroid signaling[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2014,111(42):15261-15266.

    [7]鐘春梅,王小菁. 富含半胱氨酸的GASA小分子蛋白研究進(jìn)展[J]. 植物學(xué)報(bào),2016,51(1):1-8.

    [8]Lyons J M. Chilling injury in plants[J]. Annual Review of Plant Physiology,1973,24(1):445-466.

    [9]李 飛,徐建飛,劉 杰,等. 三個(gè)耐凍性不同的馬鈴薯野生種中FAD2基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 作物學(xué)報(bào),2014,40(1):45-53.

    [10]Gigon A,Matos A R,Laffray D,et al. Effect of drought stress on lipid metabolism in the leaves of Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia)[J]. Annals of Botany,2004,94(3):345-351.

    [11]Zhang M,Barg R,Yin M G,et al. Modulated fatty acid desaturation via overexpression of two distinct omega-3 desaturases differentially alters tolerance to various abiotic stresses in transgenic tobacco cells and plants[J]. Plant Journal,2005,44(3):361-371.

    [12]Chaffai R,Elhammadi M A,Seybou T N,et al. Altered fatty acid profile of polar lipids in maize seedlings in response to excess copper[J]. Journal of Agronomy and Crop Science,2007,193(3):207-217.

    [13]盧善發(fā). 植物脂肪酸的生物合成與基因工程[J]. 植物學(xué)通報(bào),2000,17(6):481-491.

    [14]蘇華楠,王雪峰,黃愛軍,等. 高質(zhì)量提取柑橘樣品中病原總核酸方法的建立[J]. 園藝學(xué)報(bào),2014,41(11):2342-2352.

    [15]朱曉仙. 玉簪花中3個(gè)乙烯生物合成相關(guān)基因的克隆及其表達(dá)分析[D]. 金華:浙江師范大學(xué),2012.

    [16]馮延芝. 杜仲種仁轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及FAD3基因的鑒定與功能研究[D]. 北京:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院,2016.

    [17]Ko C B,Woo Y M,Lee D J,et al. Enhanced tolerance to heat stress in transgenic plants expressing the GASA4 gene[J]. Plant Physiology and Biochemistry,2007,45(9):722-728.

    [18]張 強(qiáng),孟月娥,李艷敏,等. 玫瑰GASA4-like基因的克隆及其序列分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,38(9):161-166.

    [19]McConn M,Hugly S,Browse J,et al. A mutation at the fad8 locus of Arabidopsis identifies a second chloroplast ω-3 desaturase[J]. Plant Physiology,1994,106(4):1609-1614.

    [20]袁中厚. 紫蘇ω-3脂肪酸脫氫酶基因的克隆與表達(dá)分析[D]. 重慶:重慶師范大學(xué),2014.

    [21]Somerville C. Direct tests of the role of membrane lipid composition in low-temperature-induced photoinhibition and chilling sensitivity in plants and cyanobacteria[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1995,92(14):6215-6218.周 勃,賴 寧,陳署晃,等. 施氮量對(duì)滴灌冬小麥產(chǎn)量及氮素利用的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2019,47(4):61-64.

    猜你喜歡
    基因克隆基因表達(dá)抗寒性
    抗菌肽對(duì)細(xì)菌作用機(jī)制的研究
    基因芯片在胃癌及腫瘤球細(xì)胞差異表達(dá)基因篩選中的應(yīng)用
    三個(gè)小麥防御素基因的克隆及序列分析
    美洲大蠊提取液對(duì)大鼠難愈合創(chuàng)面VEGF表達(dá)影響的研究
    二甲基砷酸毒理學(xué)的研究進(jìn)展
    棗樹抗寒性檢測(cè)方法的篩選
    巴梨的抗寒性試驗(yàn)情況初報(bào)
    馬鈴薯普通栽培種雜交后代抗寒性分析
    山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析與原核表達(dá)
    紅花低分子量油體蛋白基因的克隆與系統(tǒng)進(jìn)化分析
    亚洲avbb在线观看| 一进一出抽搐动态| www.熟女人妻精品国产| 久久国产精品人妻蜜桃| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品第二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 少妇粗大呻吟视频| 一个人免费看片子| kizo精华| 捣出白浆h1v1| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩欧美免费精品| 永久免费av网站大全| 一级,二级,三级黄色视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久精品成人免费网站| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产麻豆69| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 婷婷丁香在线五月| 黄色视频在线播放观看不卡| 蜜桃在线观看..| 亚洲黑人精品在线| av线在线观看网站| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品偷伦视频观看了| 777米奇影视久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产精品免费视频内射| 国产伦理片在线播放av一区| tocl精华| 亚洲av片天天在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费高清在线观看日韩| 久久久久视频综合| 午夜激情av网站| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 中文字幕人妻丝袜制服| 爱豆传媒免费全集在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| av天堂在线播放| 视频区欧美日本亚洲| 一进一出抽搐动态| 国产精品久久久久成人av| 国产日韩欧美亚洲二区| 69av精品久久久久久 | 十分钟在线观看高清视频www| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 香蕉丝袜av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产成人系列免费观看| 51午夜福利影视在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 丁香六月欧美| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩欧美一区视频在线观看| 岛国毛片在线播放| 亚洲avbb在线观看| 国产精品久久久久成人av| 在线 av 中文字幕| 超色免费av| 啦啦啦 在线观看视频| 1024香蕉在线观看| 999久久久国产精品视频| 丝袜喷水一区| 飞空精品影院首页| 自线自在国产av| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲av男天堂| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产欧美日韩一区二区三 | 国产精品99久久99久久久不卡| 无限看片的www在线观看| 午夜福利视频精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 91精品国产国语对白视频| 亚洲色图综合在线观看| 国产1区2区3区精品| 一级毛片女人18水好多| 亚洲中文日韩欧美视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 大香蕉久久网| 在线av久久热| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 老汉色av国产亚洲站长工具| 桃花免费在线播放| 9热在线视频观看99| 精品一区二区三卡| 国产一区二区三区综合在线观看| 黄色视频不卡| 男女下面插进去视频免费观看| 久久久久国内视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 十八禁网站网址无遮挡| 精品免费久久久久久久清纯 | 久久av网站| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 满18在线观看网站| 一进一出抽搐动态| 国产精品一区二区免费欧美 | 在线看a的网站| 亚洲国产av新网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品久久久久成人av| 亚洲精品国产av蜜桃| 天天影视国产精品| 久久精品人人爽人人爽视色| 十八禁人妻一区二区| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久精品国产欧美久久久 | 韩国精品一区二区三区| 高清视频免费观看一区二区| www.av在线官网国产| 黄色视频不卡| 国产精品九九99| 欧美xxⅹ黑人| 香蕉国产在线看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 一级毛片女人18水好多| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产一级毛片在线| 美女中出高潮动态图| 视频区欧美日本亚洲| 又大又爽又粗| 国产成人免费观看mmmm| 黄片播放在线免费| 久久久久网色| 97在线人人人人妻| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲精品自拍成人| 午夜老司机福利片| 成人影院久久| 一本综合久久免费| 男人舔女人的私密视频| avwww免费| 国产一区二区三区综合在线观看| a级毛片在线看网站| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美人与性动交α欧美软件| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲专区中文字幕在线| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲九九香蕉| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产区一区二久久| 色播在线永久视频| 激情视频va一区二区三区| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品一区二区三卡| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲国产欧美一区二区综合| 69精品国产乱码久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 免费少妇av软件| 日本精品一区二区三区蜜桃| 黄色视频,在线免费观看| 五月开心婷婷网| 免费观看人在逋| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲精品一二三| 91av网站免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产一区二区 视频在线| 咕卡用的链子| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲少妇的诱惑av| 91精品三级在线观看| 永久免费av网站大全| 日本wwww免费看| 久久ye,这里只有精品| 丰满迷人的少妇在线观看| 一级毛片女人18水好多| 天堂8中文在线网| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 脱女人内裤的视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产在视频线精品| 亚洲精品一区蜜桃| 成年人免费黄色播放视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 成人亚洲精品一区在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 777米奇影视久久| 99久久综合免费| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产主播在线观看一区二区| 美女高潮到喷水免费观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品成人在线| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 麻豆国产av国片精品| 免费不卡黄色视频| 真人做人爱边吃奶动态| 热re99久久国产66热| 欧美国产精品va在线观看不卡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 男人添女人高潮全过程视频| 一个人免费看片子| av欧美777| 亚洲中文av在线| 亚洲av国产av综合av卡| 国产男女内射视频| 不卡av一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡| av有码第一页| 亚洲国产av新网站| 咕卡用的链子| 丁香六月天网| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲熟女精品中文字幕| 精品一区在线观看国产| 99国产精品一区二区三区| 热re99久久精品国产66热6| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产国语露脸激情在线看| 国产人伦9x9x在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产一卡二卡三卡精品| 精品免费久久久久久久清纯 | 亚洲中文字幕日韩| 国产精品国产av在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 中文欧美无线码| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲中文字幕日韩| kizo精华| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久久国产一区二区| www日本在线高清视频| 国产淫语在线视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 热99re8久久精品国产| 黑人操中国人逼视频| 18禁国产床啪视频网站| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | www.自偷自拍.com| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人影院久久av| 午夜成年电影在线免费观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产精品影院久久| 国产一区二区激情短视频 | 在线 av 中文字幕| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品av久久久久免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产精品久久久av美女十八| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲avbb在线观看| 亚洲三区欧美一区| 日韩三级视频一区二区三区| 热99re8久久精品国产| 国产在视频线精品| 久热这里只有精品99| 亚洲五月婷婷丁香| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品影院久久| 男女下面插进去视频免费观看| 一级毛片精品| 黄色 视频免费看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日本av手机在线免费观看| 另类亚洲欧美激情| 国产激情久久老熟女| 国产亚洲精品第一综合不卡| 色婷婷av一区二区三区视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产欧美日韩一区二区精品| 又紧又爽又黄一区二区| 国产福利在线免费观看视频| 一本久久精品| 精品国产乱码久久久久久男人| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| tocl精华| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 一级,二级,三级黄色视频| 国产高清国产精品国产三级| 精品人妻1区二区| 桃红色精品国产亚洲av| 黄色毛片三级朝国网站| 少妇精品久久久久久久| 香蕉国产在线看| av国产精品久久久久影院| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产成人精品在线电影| 精品一区二区三区四区五区乱码| 超碰成人久久| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久这里只有精品19| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 日本a在线网址| 中文字幕最新亚洲高清| 韩国精品一区二区三区| 欧美在线一区亚洲| 午夜免费鲁丝| 少妇精品久久久久久久| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日本欧美视频一区| 国产av又大| 91老司机精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 美女中出高潮动态图| 狂野欧美激情性xxxx| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲伊人久久精品综合| 国产野战对白在线观看| 日韩中文字幕视频在线看片| 欧美97在线视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| tube8黄色片| 夜夜夜夜夜久久久久| 好男人电影高清在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 三上悠亚av全集在线观看| 99香蕉大伊视频| 不卡一级毛片| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 999久久久精品免费观看国产| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久久久久久久久久久大奶| 9热在线视频观看99| 天天操日日干夜夜撸| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 在线看a的网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 香蕉丝袜av| 亚洲国产精品一区三区| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人影院久久| www.999成人在线观看| 我的亚洲天堂| 大香蕉久久网| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产男女超爽视频在线观看| 我要看黄色一级片免费的| 黄频高清免费视频| 精品福利观看| 国产成人影院久久av| 国产精品国产三级国产专区5o| 大型av网站在线播放| 9191精品国产免费久久| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产野战对白在线观看| 大型av网站在线播放| 国产1区2区3区精品| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲一区中文字幕在线| 黄片小视频在线播放| 亚洲精品乱久久久久久| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品免费视频内射| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 青青草视频在线视频观看| 美女午夜性视频免费| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲七黄色美女视频| 在线观看免费高清a一片| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲精品乱久久久久久| 悠悠久久av| 午夜福利在线观看吧| 9191精品国产免费久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 夫妻午夜视频| 日本91视频免费播放| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜福利一区二区在线看| 色精品久久人妻99蜜桃| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 在线观看人妻少妇| 成年人黄色毛片网站| 精品福利观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 色视频在线一区二区三区| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜老司机福利片| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲av欧美aⅴ国产| 搡老熟女国产l中国老女人| 一二三四社区在线视频社区8| 国产精品欧美亚洲77777| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 免费观看a级毛片全部| 97人妻天天添夜夜摸| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久久欧美国产精品| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲男人天堂网一区| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品av久久久久免费| 五月天丁香电影| 男女边摸边吃奶| 国产日韩欧美视频二区| 女警被强在线播放| 国产成人系列免费观看| 欧美精品av麻豆av| 国产欧美亚洲国产| 国产成+人综合+亚洲专区| 69av精品久久久久久 | videos熟女内射| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲,欧美精品.| 脱女人内裤的视频| 亚洲九九香蕉| 人妻人人澡人人爽人人| 欧美激情高清一区二区三区| 18禁观看日本| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久热这里只有精品99| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 女人久久www免费人成看片| 一本综合久久免费| 天堂中文最新版在线下载| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 少妇粗大呻吟视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲精品国产区一区二| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品人妻1区二区| 色综合欧美亚洲国产小说| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产av国产精品国产| 国产精品av久久久久免费| 丝袜脚勾引网站| av网站免费在线观看视频| 性色av一级| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 美女中出高潮动态图| 两个人看的免费小视频| 黑丝袜美女国产一区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 成年人黄色毛片网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 美国免费a级毛片| 一级,二级,三级黄色视频| 悠悠久久av| 首页视频小说图片口味搜索| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲av成人一区二区三| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲成国产人片在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 精品少妇内射三级| 老鸭窝网址在线观看| 飞空精品影院首页| 日韩中文字幕视频在线看片| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 色播在线永久视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美 日韩 精品 国产| 各种免费的搞黄视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美精品一区二区大全| 午夜视频精品福利| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲精品美女久久av网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产成人免费无遮挡视频| 51午夜福利影视在线观看| 久久久精品区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 1024香蕉在线观看| 咕卡用的链子| 十八禁人妻一区二区| 老熟女久久久| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产三级黄色录像| 下体分泌物呈黄色| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 日韩制服骚丝袜av| 国产又色又爽无遮挡免| 久久精品国产综合久久久| 午夜福利在线观看吧| 日韩制服丝袜自拍偷拍| www.熟女人妻精品国产| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 一级毛片女人18水好多| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 午夜老司机福利片| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 黄片播放在线免费| 大香蕉久久网| 一本综合久久免费| 久久久久久久久久久久大奶| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 18禁观看日本| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 成人国产av品久久久| 麻豆乱淫一区二区| 久久九九热精品免费| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲人成电影免费在线| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 老司机午夜十八禁免费视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 欧美一级毛片孕妇| 两个人免费观看高清视频| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 99国产精品免费福利视频| 久久 成人 亚洲| 黄色视频,在线免费观看| 无限看片的www在线观看| 69av精品久久久久久 | 亚洲 国产 在线| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜影院在线不卡| 欧美中文综合在线视频| 大香蕉久久网| 久久久久国产精品人妻一区二区| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 18禁国产床啪视频网站| 老司机深夜福利视频在线观看 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久99热这里只频精品6学生| 永久免费av网站大全| 亚洲 国产 在线| 欧美精品av麻豆av| 中文字幕人妻丝袜制服| 不卡一级毛片| 国产激情久久老熟女| 90打野战视频偷拍视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 各种免费的搞黄视频| 日韩三级视频一区二区三区| 97人妻天天添夜夜摸| 国产熟女午夜一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美乱码精品一区二区三区| 欧美日本中文国产一区发布| 精品国内亚洲2022精品成人 | 国产片内射在线| 在线天堂中文资源库| 亚洲欧美清纯卡通| 伊人亚洲综合成人网| 午夜两性在线视频| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品亚洲成a人片在线观看| 777米奇影视久久| 久久毛片免费看一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 国产淫语在线视频| 黄片播放在线免费| 国产精品一区二区在线观看99| 久久久久网色| 久久九九热精品免费| 久久精品国产a三级三级三级| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 18禁国产床啪视频网站| 91精品国产国语对白视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 999久久久国产精品视频| 91大片在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 搡老乐熟女国产| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久精品国产a三级三级三级| 国产成人av激情在线播放| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久久国产欧美日韩av| 免费在线观看日本一区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产在线观看jvid| 亚洲国产欧美网|