抗氧化基因過表達提高運動發(fā)酵單胞菌糠醛耐受性

聞遠 夏娟 戚良華 劉小偉 劉晨光 白鳳武

（1. 微生物代謝國家重點實驗室 上海交通大學生命科學技術(shù)學院，上海 200240，2. 上海保興生物設(shè)備工程有限公司，上海 201404）

化石燃料使用帶來的環(huán)境污染和能源危機等問題亟待解決，開發(fā)可再生的清潔能源正逐漸引起廣泛關(guān)注。在眾多的可再生能源中，生物乙醇已經(jīng)成功實現(xiàn)了商業(yè)化。目前生物乙醇大多由玉米、甘蔗等淀粉類或糖類作物為底物［1］，被稱為“第一代生物乙醇”。其在美國、巴西等農(nóng)業(yè)發(fā)達國家有著較好的應(yīng)用，但在其他國家的發(fā)展具有很大的局限性，尤其是“與人爭糧、與糧爭地”的問題難以得到有效的解決。因此，以農(nóng)林廢棄物為代表的木質(zhì)纖維素為底物的“第二代生物乙醇”應(yīng)運而生［2-3］。木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此必須經(jīng)過預(yù)處理和酶解才能釋放可用于微生物發(fā)酵的糖［4］。在預(yù)處理過程中還會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物抑制微生物的生長和乙醇的生成［5］。在稀酸預(yù)處理中，木糖會轉(zhuǎn)化為糠醛，糠醛不僅消耗胞內(nèi)大量還原力，還會誘發(fā)活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生，破壞細胞中的DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)成分，損傷細胞骨架，進而引發(fā)細胞程序性死亡［6］。

工業(yè)乙醇發(fā)酵主要使用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），但在過去的幾十年中，運動發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）逐漸成為研究熱點。由于其特殊的ED（Entner-Doudoroff）途徑［7］，和釀酒酵母相比，其具有較低的產(chǎn)能效率，在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生更少的生物質(zhì)并且實現(xiàn)更高的葡萄糖-乙醇轉(zhuǎn)化效率。但是運動發(fā)酵單胞菌對糠醛毒性十分敏感［8］，因此提高運動發(fā)酵單胞菌對糠醛的耐受性將有利于該菌的工業(yè)化應(yīng)用。

為了發(fā)掘細胞抵抗抑制物毒性的基因位點，通用的研究策略是：首先通過突變、實驗室進化等方法獲得具有高耐受性表型的菌株，再采用全基因組測序、RT-qPCR等方法發(fā)掘突變或者轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化的基因，最后驗證目標基因功能［9-10］。除此之外，在高濃度醛類環(huán)境下細胞中特定氧化還原酶的表達量上調(diào)，其中一些依賴于NADH、NADPH兩種輔因子的酶類［10］，能將醛類轉(zhuǎn)化為低毒性的醇類物質(zhì)，或者消除醛類引發(fā)的ROS。NADH氧化酶與細菌的抗氧化能力密切相關(guān)［11-13］，如大部分乳酸菌Lactococcus lactis有氧生長過程中都會表現(xiàn)出該酶的活性，該酶能夠催化氧氣變成水分子，減輕氧氣誘發(fā)的ROS［13］。在光滑球擬酵母Torulopsis glabrata中異源表達L. lactis的 NADH氧化酶，可有效降低NaCl誘導的ROS，提高其高滲透壓耐受性［14］。在釀酒酵母中異源表達L. lactis的NADH氧化酶也降低了其有氧發(fā)酵條件下的ROS水平，提高菌株發(fā)酵性能［15］。NADP+還原酶催化NADPH的再生，而NADPH作為一種重要的輔因子，為抗氧化系統(tǒng)中還原型谷胱甘肽和硫氧還蛋白的再生提供還原力［16］。谷胱甘肽還原酶是抗氧化系統(tǒng)中的重要成員，依賴NADPH催化氧化型谷胱甘肽向還原型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化［17-18］，本研究著重研究在運動發(fā)酵單胞菌中，過表達其內(nèi)源NADH氧化酶基因ZMO1885、NADP+還原酶基因ZMO1753及谷胱甘肽還原酶基因ZMO12111，探究這些具有抗氧化功能的重組菌株在糠醛脅迫條件下的生長發(fā)酵性能。

1 材料與方法

1.1 材料

靶基因的選擇 通過在KEGG數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/）中篩選，找到運動發(fā)酵單胞菌的NADH氧化酶基因ZMO1885、NADP+還原酶基因ZMO1753和谷胱甘肽還原酶基因ZMO1211，并且對其進行過表達操作。

菌株、質(zhì)粒及引物 本實驗所使用的菌株、質(zhì)粒和引物見表1和表2。出發(fā)菌株為野生型運動發(fā)酵單胞菌Z. mobilisZM4。用以表達載體構(gòu)建的菌株為大腸桿菌DH5α，用以載體去甲基化的菌株為大腸桿菌JM110。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 運動發(fā)酵單胞菌使用RM培養(yǎng)基，大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化鈉，固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20 g/L。RM培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、2 g/L磷酸二氫鉀、10 g/L酵母提取物，固體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L。模擬木質(zhì)纖維素水解液：60 g/L葡萄糖、20 g/L木糖，2 g/L磷酸二氫鉀，10 g/L酵母提取物，發(fā)酵前加入0.53 g/L糠醛、0.36 g/L 5-HMF、0.34 g/L 甲酸、4.33 g/L 乙酸［19］。

培養(yǎng)含有目標表達載體的菌體，在培養(yǎng)基中添加鹽酸四環(huán)素（Tc）20 mg/L。E.coliDH5α和JM110于1.5 mL離心管、37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為1 mL。Z. mobilisZM4使用250 mL搖瓶于30℃培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為150 mL，在種子培養(yǎng)時靜置，發(fā)酵時150 r/min振蕩培養(yǎng)。

表1 本實驗使用的菌株和質(zhì)粒

表2 本實驗構(gòu)建菌株所使用的引物

1.2.2 菌株構(gòu)建與活化 以ZM4基因組為模板獲得Pgap、ZMO1885、ZMO1753、ZMO1211片段。用限制性內(nèi)切酶EcoR I和PstI切割pHW20a質(zhì)粒，后經(jīng)凝膠電泳切膠純化后，利用同源重組的方法將目的基因和啟動子Pgap連接在線性化載體pHW20a上，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。為克服運動發(fā)酵單胞菌限制修飾系統(tǒng)對轉(zhuǎn)化效率的影響，將大腸桿菌DH5α中提取的表達載體轉(zhuǎn)入JM110菌株中去甲基化。每80 μL感受態(tài)細胞加入1 μg去甲基化的質(zhì)粒，靜置10 min后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1 mm電轉(zhuǎn)杯中，電擊轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化子通過PCR以及電泳驗證無誤后保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

重組運動發(fā)酵單胞菌活化：取-80℃保存的重組運動發(fā)酵單胞菌在含有20 mg/L Tc的RM固體培養(yǎng)基上三區(qū)法劃線活化，置于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2-3 d，待菌落長出后，挑菌至含有20 mg/L Tc的RM液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20 h，再轉(zhuǎn)接經(jīng)二次活化，用于后續(xù)發(fā)酵實驗。

1.2.3 重組菌株生長及耐受性能的測定 于-80℃保存菌株中隨機挑取3個轉(zhuǎn)化子用于生長性能評定。重組運動發(fā)酵單胞菌經(jīng)活化后，將OD600調(diào)為1.5以1%轉(zhuǎn)接入150 mL含有20 mg/L Tc的RM液體培養(yǎng)基中，于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)約15 h，將其OD600調(diào)為1.5 后10%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每4 h取樣測量OD600，繪制生長曲線。對于耐受性能的評估，在發(fā)酵前加入糠醛2 g/L。

1.2.4 RT-qPCR驗證 發(fā)酵6 h后取9 mL發(fā)酵液，10 000 r/min 離心2 min收集細胞，用ddH2O洗滌2次，液氮速凍用于RNA提取。使用總RNA 抽提純化試劑盒（Total RNA Extraction and Purification Kit，Sangon Biotech）提取總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit，TaKaRa）將總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA作為模板，再利用定量試劑盒（iQTM SYBR? Green，Bio-Rad）進行表達量檢測，以2-ΔΔCt方法比較重組菌株和對照菌株目標基因的轉(zhuǎn)錄量，以ZMOr009為內(nèi)參基因。本實驗中使用的實時定量引物見表3。

表3 本文使用的實時定量引物

1.2.5 NADH氧化酶酶活測定 使用NADH氧化酶測試盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定細胞內(nèi)NADH氧化酶酶活。發(fā)酵6 h后取9 mL發(fā)酵液，離心收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，根據(jù)試劑盒方法進行酶活的測定。

1.2.6 胞內(nèi)活性氧檢測 使用探針2'，7' -二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）測定2 g/L糠醛條件下重組菌株和對照菌株細胞內(nèi)ROS水平。發(fā)酵6 h后取9 mL發(fā)酵液，將OD600調(diào)為0.25，取4.5 mL發(fā)酵液，離心收集菌體，用PBS洗2遍菌體。后用500 μL的PBS重懸菌體，加入40 μL H2DCFDA，在黑暗條件下于30℃，200 r/min反應(yīng)1 h。離心收集細胞，再用PBS洗去多余的熒光染料，后用500 μL的PBS重懸細胞，吸取200 μL于96孔板（黑色背景）中，使用全波長掃描儀（ENSPIRE 2300，PE），在485 nm下的激發(fā)光和535 nm下的發(fā)射光下測定其熒光強度，ROS的量以熒光強度表示。

1.2.7 NAD+及NADH 測定 使用NAD+/NADH（NAD+/NADH Assay Kit，碧云天公司）測定細胞內(nèi)NADH及NAD+水平。發(fā)酵6 h后取9 mL發(fā)酵液，離心收集細胞，用PBS洗滌2次。測量NAD+的樣品重懸于1 mL 0.2 mol/L HCl 中，測量NADH的樣品重懸于0.2 mol/L NaOH中。超聲破碎細胞后將懸浮液煮沸5 min，在冰浴中快速淬火，然后在離心管中先后加入500 μL的樣品和500 μL 0.2 mol/L NaOH（測量NAD+）或0.2 mol/L HCl（測量NADH）。將混合物10 000 r/min離心10 min后，收集上清液，根據(jù)NADH檢測試劑盒的方案，用上清液測定NAD+和NADH的含量。

1.2.8 模擬木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵性能檢測 將種子培養(yǎng)至OD600約2.5，20%接種于模擬木質(zhì)纖維素水解液中。每12 h取一次樣測量OD600，繪制生長曲線。發(fā)酵液中葡萄糖、乙醇、糠醛、5-HMF含量分析采用 Waters e2695 高效液相色譜（Waters，MA，USA）系統(tǒng)，裝配 Aminex HPX-87H 有機酸分析柱（300 mm×7.8 mm，Hercules，Bio-Rad）和示差檢測器（Waters 2414）。進樣量 20 μL，流動相為 0.004 mol/L的硫酸溶液，流速 0.6 mL/min，示差檢測器溫度 50℃，柱溫 65℃。

2 結(jié)果

2.1 重組菌株生長性能評價

利用質(zhì)粒pHW20a分別過表達基因ZMO1885、ZMO1753、ZMO1211，探究過表達基因?qū)τ谶\動發(fā)酵單胞菌生長性能的影響。如圖1-A所示，過表達ZMO1885和ZMO1211對菌株的生長沒有顯著影響，但是過表達ZMO1753卻對菌株的生長產(chǎn)生了明顯的負面影響。菌株到達穩(wěn)定期的時間延長，最大OD600降低，僅能達到對照菌株的90.03%。在耗糖能力和乙醇生產(chǎn)能力上，和對照菌株相比，ZMO1885（圖1-B）和ZMO1211（圖1-D）過表達菌株沒有明顯差異。但是，過表達ZMO1753基因的工程菌株受生長減慢的拖累，耗糖速度和乙醇的產(chǎn)率都明顯降低（圖1-C）。運動發(fā)酵單胞菌的單基因操作可對其生長性能產(chǎn)生負面影響，降低的生物量進而影響到糖耗速率和乙醇生產(chǎn)力。因此，在獲得重組菌株后有必要對其生長性能、糖耗、乙醇生產(chǎn)力進行評估。

2.2 重組菌株耐受性能評價

為考察糠醛抑制對照菌株ZM4/20a生長的效果，將ZM4/20a置于含有0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的糠醛培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，測得細胞的生長曲線以及達到穩(wěn)定期的OD600。

如圖2-A所示，高濃度的糠醛抑制了細胞的生長，不僅降低了細胞在對數(shù)生長期的生長速度，還延遲了細胞到達穩(wěn)定期的時間。由于菌株在24 h可以達到最大OD600。對菌株最大OD600和與之對應(yīng)的糠醛濃度進行擬合（圖2-B），計算得糠醛的IC50為0.865 g/L，IC75約為2 g/L。為了篩選出耐受性較強的菌株，選擇IC75（～2 g/L）的糠醛濃度檢測3個重組菌株的生長。選擇24 h進行生物量的比較，初步評估其耐受性能（表4）。

圖1 重組菌株生長性能評價

圖2 糠醛耐受曲線

表4 重組菌株耐受性評估

如表4，在無糠醛的條件下ZM4/ZMO1885與ZM4/20a的 OD600沒有顯著差異，但是在2 g/L糠醛的抑制下，ZM4/ZMO1885凸顯出生長優(yōu)勢，其OD600是對照組的138.48%，表明過表達ZMO1885能夠提高菌株對于糠醛的耐受性。

過表達ZMO1753基因會使得菌株在正常培養(yǎng)條件下生長差于對照菌株，僅能達到對照最大OD600的90.03%，但是在含有2 g/L的糠醛條件下生長時，其最大OD600略高于對照菌株ZM4/20a，能達到其最大OD600的109.07%。盡管ZMO1753基因過表達干擾了菌株的正常生長，但在糠醛抑制條件下ZMO1753編碼的酶提高了糠醛耐受性，從而抵消了其對于菌株生長的負面影響。

過表達ZMO1211沒有影響菌株在無糠醛培養(yǎng)基中的生長，但是在2 g/L糠醛存在的條件下，卻降低了菌株對于糠醛的耐受性，最大OD600僅能達到對照菌株的74.1%。

對于代謝網(wǎng)絡(luò)簡單、產(chǎn)能效率低下的運動發(fā)酵單胞菌而言，需要考慮改造基因是否會對菌株生長造成負面影響，同時在判斷基因?qū)τ诿{迫耐受作用時，也必須扣除掉該基因操作對生長性能的影響。

2.3 胞內(nèi)活性氧自由基檢測

在運動發(fā)酵單胞菌中過表達ZMO1885編碼的NADH氧化酶可以提高菌株對糠醛的耐受性，過表達ZMO1753也對糠醛耐受性提高有一定的效果。進一步檢測 ZM4/20a、ZM4/ZMO1885、ZM4/ZMO1753菌株胞內(nèi)的ROS水平，探索耐受性提高與基因抗氧化功能之間的相關(guān)性。

圖3 重組菌株及對照菌株ROS水平測定

如圖3所示，ZMO1885編碼的NADH氧化酶過表達能顯著降低胞內(nèi)的ROS水平。和對照菌株ZM4/20a相比，菌株ZM4/ZMO1885的ROS水平降低了52.10%，減輕糠醛所引發(fā)的ROS對細胞的傷害，改善了菌株在糠醛條件下的生長狀態(tài)。ZMO1753過表達菌株中ROS水平也顯著下降，說明該基因也能降低糠醛引發(fā)的ROS。但該基因過表達給菌體生長帶來的負面作用，抵消了部分耐受糠醛的優(yōu)勢，生長性能上僅略優(yōu)于對照菌株。

2.4 ZMO1885過表達菌株基因表達效果分析

通過生物量和ROS實驗，證明了所挑選3個基因中僅ZMO1885過表達能夠顯著去除胞內(nèi)ROS，并顯著提高菌株在糠醛抑制下的生物量。為考察該基因過表達對細胞的其他影響，表5展示重組菌株與對照菌株的ZMO1885基因表達量、NADH氧化酶酶活及NADH/NAD+比值。盡管構(gòu)建菌株中使用了強啟動子Pgap，重組菌中的ZMO1885表達量僅僅比對照菌株上調(diào)了2.26倍，該基因的表達量可能受到細胞嚴格控制。NADH氧化酶酶活實驗與轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)相符合，實驗測得的所有以NADH為輔因子的全細胞NADH氧化酶酶活僅微弱上升8.28%。一方面重組菌中的酶量和酶活改變小，另一方面，細胞內(nèi)除ZMO1885編碼的NADH氧化酶外，還存在其他能利用NADH作為輔因子的氧化還原酶，因此導致胞內(nèi)的NADH/NAD+比例并沒有顯著的差異。綜上所述，過表達ZMO1885并未引起運動發(fā)酵單胞菌氧化還原水平失衡的現(xiàn)象，不會影響其他利用NADH作為輔因子的氧化還原酶的功能。因此在無抑制物添加情況下并沒有造成對菌體生長的影響。而當有糠醛加入后，又能發(fā)揮自身的功能去除ROS，避免細胞死亡。

表5 ZMO1885過表達效果檢測

2.5 NADH氧化酶過表達菌株在模擬木質(zhì)纖維素水解液中發(fā)酵效果

在木質(zhì)纖維素預(yù)處理水解液中，除了糠醛之外，還存在多種其他種類的重要抑制物：甲酸、乙酸、5-HMF等。因此，基于之前實驗結(jié)果，挑取表型最優(yōu)的菌株ZM4/ZMO1885采用模擬木質(zhì)纖維素水解液進一步驗證其發(fā)酵性能及耐受性能。

表6為對照菌株和重組菌株在對數(shù)生長中期發(fā)酵性能上的差異。在模擬木質(zhì)纖維素水解液中，ZM4/ZMO1885的生長顯著優(yōu)于對照菌株ZM4/20a，相應(yīng)的發(fā)酵性能也有所提高。在發(fā)酵時長達到對數(shù)中期36 h，ZM4/ZMO1885的殘?zhí)橇績H為ZM4/20a的20.56%，而乙醇濃度為其2.95倍。在前36 h內(nèi)，菌株ZM4/ZMO1885的生物量提高了46.91%，糖耗速率提高了110.29%，乙醇生產(chǎn)力提高了195.24%。不僅如此，重組菌株針對水解液中的糠醛及5-HMF的去除率更高，分別為98.10%和64.55%，而對應(yīng)的對照菌株僅為89.39%和30.79%（圖4）。

3 討論

本實驗所研究的基因ZMO1885、ZMO1753、ZMO1211均為運動發(fā)酵單胞菌內(nèi)源基因。其編碼的酶均具有抗氧化能力，減輕由糠醛誘發(fā)的ROS對細胞的損害（圖5）。

對運動發(fā)酵單胞菌進行基因工程操作時，要嚴格考慮選取的基因并對重組菌株進行生長性能檢測。ZMO1885和ZMO1211的過表達未對菌株的生長、糖耗、乙醇生產(chǎn)產(chǎn)生明顯的影響。過表達ZMO1753會引起其生長的滯后以及最大OD600的降低，造成糖耗速度和乙醇生產(chǎn)力變低。由基因操作引起的生長性能改變歸因于兩方面：（1）運動發(fā)酵單胞菌代謝網(wǎng)絡(luò)簡單和生產(chǎn)能量效率低。運動發(fā)酵單胞菌沒有完整三羧酸循環(huán)，每消耗1 mol葡萄糖，只能經(jīng)由ED途徑產(chǎn)生1 mol ATP［21］。因此，即使過表達單個基因，也可能對菌株的代謝網(wǎng)絡(luò)造成嚴重的擾動。（2）運動發(fā)酵單胞菌中特定基因的具體功能。ZMO1885編碼的NADH氧化酶及ZMO1211編碼的谷胱甘肽還原酶的過表達均未給細胞生長造成嚴重的干擾，由于NADH氧化酶為非核心的細胞氧化酶，有許多同工酶發(fā)揮作用，而谷胱甘肽還原酶在沒有抑制的條件下，對細胞生長并無直接關(guān)聯(lián)；ZMO1753編碼的NADP+還原酶的過表達顯著抑制菌株生長，這可能由于其影響胞內(nèi)鐵氧還蛋白等重要物質(zhì)的含量［22-24］。在2 g/L糠醛的條件下，若扣除基因改造對菌株生長的負面影響，ZMO1753過表達也略微提高了細胞對糠醛的耐受性。在釀酒酵母中，其磷酸戊糖途徑（Pentose phosphate pathway，PPP）和抗氧化性的關(guān)聯(lián)性也早已被證實，敲除PPP途徑中的關(guān)鍵基因，會導致其抗氧化性下降［25］。過表達PPP中的限速酶，提高NADPH的含量，而NADPH作為多種過氧化酶的重要輔因子協(xié)助其清除胞內(nèi)ROS，從而提高菌株的耐受性［4，26］。

表6 對數(shù)生長中期（36 h）菌株在模擬木質(zhì)纖維素水解液中發(fā)酵性能比較

圖4 模擬木質(zhì)纖維素水解液中重組菌株ZM4/ZMO1885及對照菌株ZM4/20a糠醛和5-HMF轉(zhuǎn)化率

圖5 ZMO1885、ZMO1753、ZMO1211糠醛耐受性機理圖

NADH氧化酶對于微生物有氧生長過程中的抗氧化性已被證實［11-12］，如乳酸菌的有氧生長中該酶發(fā)揮著重要的抗氧化作用［13］。在光滑球擬酵母Torulopsis glabrata異源表達來源于乳酸菌Lactococcus lactisNADH氧化酶，可以有效降低NaCl誘導的ROS，減少ROS給細胞帶來的傷害，提高其高滲透壓耐受性［14］；而在釀酒酵母中異源表達L. lactis的NADH氧化酶也有類似的效果，降低了其有氧發(fā)酵條件下的ROS水平［15］。糠醛會誘發(fā)細胞產(chǎn)生大量ROS，對細胞各種微結(jié)構(gòu)造成損傷［6，27］。在2 g/L糠醛的條件下，ZMO1885過表達菌株糠醛耐受性顯著提升，歸因于NADH氧化酶去除ROS的能力。在含有多種抑制物的模擬木質(zhì)纖維素水解液中，ZMO1885過表達菌株展示高耐受性能，與糠醛的單抑制物條件下的結(jié)論相一致。

NADH氧化酶催化NADH的氧化［15］，而NADH作為一種重要的還原性輔因子參與細胞中多種氧化還原反應(yīng)［28-29］。NADH/NAD+的變化會給細胞生長帶來負面影響，或影響目標產(chǎn)物的生成［30-32］。在運動發(fā)酵單胞菌中，催化糠醛轉(zhuǎn)化為糠醇的脫氫酶或醛酮還原酶需消耗NADH或NADPH［33］。因此NADH氧化酶過表達引發(fā)胞內(nèi)NADH水平大幅降低可能會干擾其他氧化還原酶，進而影響細胞生長和耐受性。在本實驗中，ZMO1885基因的過表達僅在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生有限倍數(shù)的上調(diào)，對胞內(nèi)NADH/NAD+水平影響有限，該基因未造成胞內(nèi)氧化還原失衡，并未影響細胞的生長狀態(tài)，但是其催化功能降低了ROS的含量，因此提高了菌株對于糠醛的脅迫耐受性。

4 結(jié)論

在運動發(fā)酵單胞菌中過表達NADH氧化酶基因ZMO1885，能夠在不干擾胞內(nèi)NADH/NAD+水平的前提下，通過降低胞內(nèi)ROS水平、強化糠醛的去除增強了菌株的糠醛耐受性。在模擬木質(zhì)纖維素水解液中，重組菌株ZM4/ZMO1885的生長發(fā)酵性能顯著優(yōu)于對照菌株ZM4/20a。