粟酒裂殖酵母蛋白Atp4定位和功能的研究

李琴 張琳琳 黃鷹

（南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210023）

線粒體是細(xì)胞內(nèi)代謝活動的主要中樞，參與多種重要的細(xì)胞過程，包括鐵硫簇的生物合成，鈣穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞凋亡等。氧化磷酸化產(chǎn)生ATP是線粒體最重要的作用，該過程需要五個多亞基蛋白質(zhì)復(fù)合物；其中四個構(gòu)成線粒體呼吸鏈并參與電子傳遞過程，電子轉(zhuǎn)移在線粒體內(nèi)膜上產(chǎn)生質(zhì)子梯度，最后被復(fù)合物V（ATP合成酶）利用以合成ATP［1-3］。由于線粒體結(jié)構(gòu)和功能固有的復(fù)雜性，線粒體功能障礙與諸多的人類疾病有關(guān)，例如糖尿病、肥胖癥、心血管疾病、癌癥，以及線粒體功能衰老［4-7］。其中，復(fù)合體V中ATP合酶的缺乏會導(dǎo)致心肌病、腦病和白內(nèi)障等疾?。?-9］。

釀酒酵母的ATP合成酶由至少13種不同種類的亞基組成，5個亞基（α3β3γδ和ε）組成酵母F1，F(xiàn)0 包含 8 個不同的亞基（4、OSCP、d、h 和 f）［10］。通過pombase數(shù)據(jù)庫分析，粟酒裂殖酵母中Atp4被預(yù)測為線粒體ATP合酶F0的組成蛋白，參與線粒體的能量代謝過程并與線粒體ATP的產(chǎn)生密切相關(guān)。它在人和芽殖酵母中的同源蛋白，分別ATP5PB和ATP4。芽殖酵母中ATP4是核基因編碼的大小為25 kD的ATP合酶亞基4。人們發(fā)現(xiàn)ATP4是F0的一個定子，參與F0F1-ATP合酶的組裝，功能上與ATP合酶的二聚體的形成，維持內(nèi)膜嵴的形狀和ATP合酶的磷酸化有關(guān)［11-12］。在人中，核基因編碼蛋白ATP5PB成為線粒體ATP合酶F1-F0的亞基b，與酵母線粒體ATP4的同源性為31%［13-14］。通過同源比對發(fā)現(xiàn)裂殖酵母Atp4與人中ATP5PB的同源性達(dá)到64%，預(yù)測Atp4參與線粒體功能發(fā)揮，而且到目前為止，在粟酒裂殖酵母中還沒有Atp4功能的研究。因此本文旨在探究粟酒裂殖酵母中Atp4參與線粒體功能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 粟酒裂殖酵母單倍體菌株 yHL6381（h+，his3-D1，leu1-32，ura4-D18，ade6-M210）、 大 腸 桿 菌Escherichia coliTop10、pFA6a-KanMX6、pYJ19為本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 YES培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，葡萄糖 20 g/L，adenine、histidine、uracil、leucine 各 200 mg/L，2%瓊脂粉（固體）；YES+6%、3%甘油：每100 mL YES培養(yǎng)基加入12 mL、6 mL 50% 甘油；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，1.5%瓊脂粉（固體）；LBAMP+培養(yǎng)基：每100 mL LB培養(yǎng)基加入氨芐青霉素鈉（終濃度0.1 mg/mL）；EMmLeu-（Edinburghminimal medium） 培養(yǎng)基：鄰苯二甲酸氫鉀3 g/L，十二水合磷酸氫二鈉5.55 g/L，氯化銨5 g/L，10 mL 100×salt stock，1 mL 1 000×vitamin，0.1 mL 10 000×mineral stock，adenine、uracil、histidine各 225 mg/L，葡萄糖 20 g/L，2%瓊脂粉（固體）。葡萄糖單獨滅菌。

1.1.3 儀器和試劑 限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR DNA Polymerase、PCR反應(yīng)試劑和連接酶均購自Takara；PCR引物由南京捷瑞合成；DNA Marker購自南京百思凱；DNA純化和割膠回收試劑盒購自南京博巧；SDS、HEPES、Sorbitol、Tris、30%丙烯酰胺等試劑購自上海生工，尼龍膜購買于GE。主要儀器有PCR儀，臺式高速離心機，Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)，電泳槽等。

1.2 方法

1.2.1 Δatp4菌種構(gòu)建 以pFa6a-kanMX6為出發(fā)質(zhì)粒，以yHL6381酵母基因組為模板擴(kuò)增得到up-同源臂以及down-同源臂。將up-同源臂構(gòu)建到質(zhì)粒上游酶切位點SalI和BglII間，down-同源臂構(gòu)建到質(zhì)粒下游EcoRI和EcoRV間。設(shè)計引物將up-同源臂、抗性標(biāo)簽、down-同源臂擴(kuò)增得到單一目的條帶后，醋酸鋰轉(zhuǎn)化到y(tǒng)HL6381內(nèi)通過同源重組敲除基因atp4。

1.2.2 點板實驗 實驗前3 d將菌種yHL6381和Δatp4于固體平板YES上劃線活化。將活化菌種接種至培養(yǎng)基內(nèi)，過夜培養(yǎng)。第二天將種子液重新轉(zhuǎn)接到10 mLYES液體培養(yǎng)基內(nèi)，并將OD都調(diào)至0.2左右，于搖床，30℃，200 r/min，培養(yǎng)12 h。將yHL6381和Δatp4菌液初始OD均調(diào)至3左右，按10 倍梯度依次稀釋為 1、10-1、10-2、10-3、10-4。取2.5 μL點圈于甘油平板上。30℃，倒置平板培養(yǎng)3-5 d。拍照。每塊平板重復(fù)3份，整個實驗重復(fù)3次。

1.2.3 Atp4定位預(yù)測分析 粟酒裂殖酵母數(shù)據(jù)庫pombase顯示Atp4定位于線粒體，通過網(wǎng)站Mitoprot II（https：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.htmL） 分析Atp4的氨基酸序列是否具有線粒體定位序列，預(yù)測Atp4 N-端前29個氨基酸為線粒體定位序列：METSSKLSPVQRTTAAWQRLLPSTRFSL，序列可信度為56.13%。因此我們推測Atp4定位于線粒體內(nèi)。

1.2.4 熒光顯微鏡觀察Atp4定位 取質(zhì)粒pYJ19-atp4-GFP用NruI進(jìn)行單酶切，酶切完后熱失活處理，取1 μg通過LiAc導(dǎo)入到y(tǒng)HL6381內(nèi)，涂布于EMM（Ade，His，Ura）篩選平板上。3-4 d后挑選大小合適的轉(zhuǎn)化子在EMM篩選平板上劃線。2 d后將菌株接種于相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基內(nèi)，過夜后轉(zhuǎn)接至OD600=0.2，培養(yǎng)至OD600=0.6左右，收菌，PBS緩沖洗一次后，加入Mitotracker染料常溫染色2-3 min后，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 線粒體定位實驗 實驗以Tom20（線粒體外膜蛋白）和Hsp60（線粒體基質(zhì)蛋白）為對照。分別用TritonX-100和蛋白酶K處理線粒體，TritonX-100將線粒體外膜消解而使得蛋白暴露于蛋白酶K環(huán)境下被其水解。堿性碳酸鈉使線粒體膜打開釋放內(nèi)容物，位于基質(zhì)的蛋白分布在上清中，而線粒體膜蛋白則分布在沉淀內(nèi)。用不同處理并與對照蛋白相對應(yīng)，從而確定目的蛋白的定位。

1.2.6 Western blotting檢測線粒體蛋白表達(dá)量 分別提取純化Δatp4和yHL6381線粒體，并用BCA法測取濃度。取等量的線粒體分別進(jìn)行以下處理：100℃煮 10 min用以 檢 測 Cox2、Cox4、Atp6和 Hsp60；45℃水浴3 min用以檢測Cox1、Cob1和Cox3。將處理后的線粒體蛋白上樣于12% SDS-PAGE，80 V電泳30 min，120 V電泳90 min。轉(zhuǎn)膜300 mA，100 min。5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗常溫孵育2 h。二抗常溫避光孵育1 h。Odyssey Infrared Imaging檢測實驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及酶切驗證

Δatp4的構(gòu)建和驗證：選擇atp4編碼區(qū)前384 bp作為上游同源臂和編碼區(qū)后面550 bp作為下游同源臂，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切驗證（圖1-A-B）；將上游同源臂+KanMX+下游同源臂的融合片段導(dǎo)入yHL6381內(nèi)，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，野生型為2 305 bp，轉(zhuǎn)化子為2 504 bp（圖1-C）；atp4-flag的構(gòu)建和驗證：選擇atp4編碼區(qū)前面和后面約500 bp作為上、下游同源臂（圖1-D）；上、下游構(gòu)建酶切驗證（圖1-E）；將上游同源臂+Flag+下游同源臂的融合片段導(dǎo)入yHL6381內(nèi)，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，野生型為1 449 bp，轉(zhuǎn)化子為3 510 bp（圖1-F）。

2.2 Δatp4菌株的表型研究

為研究敲除菌的表型，構(gòu)建了Δatp4菌株并在以葡萄糖或甘油為唯一碳源的YES固體培養(yǎng)基上點圈，以yHL6381為陰性對照。結(jié)果（圖2）顯示，在YES發(fā)酵平板上，敲除菌株和野生型菌株生長狀況一致。在含3%和6%甘油非發(fā)酵平板上，Δatp4菌株的生長明顯減緩。說明atp4基因的敲除使得菌株呼吸缺陷，從而使線粒體蛋白功能發(fā)揮異常。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證

圖2 Δatp4在甘油平板上的生長情況

2.3 Atp4的定位研究

2.3.1 熒光顯微鏡觀察 利用GFP追蹤Atp4，Mitotracker追蹤線粒體以確定蛋白定位。Atp4-GFP在顯微鏡下發(fā)出綠色熒光（圖3），Mitotracker染色顯示線粒體部分為紅色。將兩者進(jìn)行磨合后，重疊部分顯示為黃色。結(jié)果表明，Atp4定位于線粒體。

圖3 Atp4-GFP的熒光顯微鏡觀察

2.3.2 TritonX-100和蛋白酶K處理 為了進(jìn)一步研究Atp4定位在外膜還是內(nèi)部，選擇Tom20（線粒體外膜蛋白）和Hsp60（線粒體基質(zhì)蛋白）作為對照。結(jié)果（圖4）顯示，Atp4不定位于線粒體外膜，可能定位于線粒體基質(zhì)或者內(nèi)膜。

圖4 TritonX-100和蛋白酶K處理線粒體后蛋白情況

2.3.3 堿性碳酸鈉處理 Atp4定位于線粒體基質(zhì)或內(nèi)膜，接下來利用堿處理線粒體確定定位。以Cox2（內(nèi)膜蛋白）和Hsp60（線粒體基質(zhì)蛋白）作為對照。結(jié)果（圖5）顯示，Atp4主要分布在沉淀中，上清中只有少量，與內(nèi)膜蛋白Cox2相同。表明Atp4定位于線粒體內(nèi)膜。

圖5 堿性碳酸鈉處理線粒體后蛋白情況

2.4 Atp4缺失導(dǎo)致線粒體呼吸鏈蛋白表達(dá)降低

粟酒裂殖酵母的線粒體中僅合成了8種主要蛋白質(zhì)，包括呼吸復(fù)合體III（Cob1），IV（Cox1，Cox2，Cox3）和V（Atp6，Atp8和Atp9）的亞基和核糖體蛋白小亞基（Var1）［15-16］。上述實驗已經(jīng)證明atp4定位于線粒體，因此我們檢測了由線粒體編碼的蛋白（Cob1、Cox1、Cox2、Cox3、Atp6）以及由核編碼的定位于線粒體的蛋白Cox4，以內(nèi)參Hsp60作為上樣控制。

Western blotting結(jié)果（圖6）顯示，相較于yHL6381菌株，Δatp4菌株內(nèi)線粒體蛋白Cob1、Cox1、Cox2、Atp6表達(dá)量明顯下降，Cox3和Cox4蛋白表達(dá)量也相應(yīng)有略微下降。這表明atp4缺失影響了線粒體編碼的電子傳遞鏈蛋白的表達(dá)，從而影響了線粒體呼吸鏈復(fù)合體的組裝。結(jié)合點圈結(jié)果顯示的Δatp4菌株在非發(fā)酵型培養(yǎng)基上出現(xiàn)了生長抑制的現(xiàn)象，判斷該現(xiàn)象是由于該基因的缺失導(dǎo)致線粒體蛋白表達(dá)量降低而不能正常氧化磷酸化造成的。

圖6 Western blotting檢測Δatp4菌株中線粒體相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)量

3 討論

芽殖酵母缺失ATP4突變菌株，在非發(fā)酵培養(yǎng)基上出現(xiàn)了生長缺陷，這是由于影響了ATP合酶的正常組裝導(dǎo)致的［17-18］。ATP4包括TM1（25-46 aa）和TM2（56-76 aa）以及中間環(huán)（47-55 aa）。其中，缺失中間環(huán)，引起了線粒體形態(tài)變化（嵴呈現(xiàn)為細(xì)長的片狀）［19-20］；破壞C-端親水結(jié)構(gòu)域，其突變菌株的氧化磷酸化功能喪失，ATP合酶與膜的結(jié)合也變得松散［21］。本文研究發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母Δatp4菌株在非發(fā)酵培養(yǎng)基上表現(xiàn)出呼吸缺陷；通過熒光觀察和生化處理線粒體實驗得出Atp4是在線粒體內(nèi)膜上發(fā)揮功能，因此推測Atp4可能參與線粒體呼吸鏈蛋白亞基的組裝和ATP的產(chǎn)生。通過Western blotting實驗結(jié)果表明缺失Atp4引起了Cob1、Cox1、Cox2、Atp6表達(dá)量劇烈下降，說明Atp4的缺失不僅僅影響了復(fù)合體V的組裝也使得上游呼吸鏈復(fù)合體III和IV發(fā)生解離。

芽殖酵母的ATP4與裂殖酵母的Atp4為同源蛋白，通過Blast氨基酸序列比對分析得出，序列同源性大約是82%，但是N端前40個氨基酸并不保守。ATP4在芽殖酵母中是F0組成蛋白，對于ATP合酶的正常組裝和氧化磷酸化的進(jìn)行十分重要。在粟酒裂殖酵母內(nèi)Δatp4菌株出現(xiàn)呼吸缺陷，線粒體蛋白表達(dá)量劇烈下降。Atp4對于粟酒裂殖酵母正常氧化磷酸化是必不可少的。但是Atp4缺失是影響蛋白的正常合成還是穩(wěn)定仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

表型研究發(fā)現(xiàn)粟酒裂殖酵母atp4缺失后菌株出現(xiàn)生長缺陷。熒光顯微鏡觀察和生化試劑TritonX-100和蛋白酶K處理以及堿性碳酸鈉處理線粒體實驗證明Atp4定位于線粒體內(nèi)膜。Western blotting檢測結(jié)果表明Atp4缺失菌株內(nèi)線粒體基因組編碼蛋白Cob1、Cox1、Cox2和Atp6 表達(dá)量降低。