補腎填精法對化療源性卵巢早衰大鼠生育力保存的影響

郭淑敏， 彭慧娟， 周秀麗， 朱玲

（1.廣州中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東廣州 510120；3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東廣州 510405）

腫瘤及自身免疫性疾病發(fā)病率正逐年上升，化療藥是治療此類疾病的重要藥物。部分化療藥物的性腺毒性已經(jīng)得到臨床及實驗證實，其中卵巢毒性風險系數(shù)最高的是烷化劑，以環(huán)磷酰胺（CTX）為代表性藥物?；熕幬镏委熢l(fā)病的同時導致年輕女性患者卵巢功能損傷甚至出現(xiàn)卵巢早衰[1]（premature ovarian failure，POF）的副作用日漸凸顯，增加了不孕不育的風險，嚴重影響女性患者的生育健康。化療源性POF的發(fā)病機理及治療藥物的臨床療效評價已成為研究熱點。POF西醫(yī)治療方法包括雌孕激素替代治療、促排卵、贈卵、卵巢冷凍移植等，手段局限，歷時長，效果不甚理想。而中醫(yī)藥因治療POF方法簡便、療效可靠而被廣泛運用于臨床，值得深入研究。明代張景岳創(chuàng)立的補腎填精法代表方左歸丸體現(xiàn)了“陽中求陰”的制方特點，有滋腎陰，養(yǎng)精血，兼具活血之功，臨床用于治療POF取得一定的療效[2]。本研究通過腹腔注射CTX建立化療源性POF大鼠模型，觀察左歸丸干預后對化療源性POF大鼠受孕能力的影響，以期為臨床保存化療源性POF患者生育力治療提供參考，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇9周齡SPF級雌性SD大鼠121只，雄性SD大鼠20只，平均體質量180～220 g。由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物許可證號：44007200026331。實驗前行陰道涂片，有正常動情周期的雌鼠納入實驗。

1.2 實驗藥物、試劑與儀器 左歸丸，每瓶45 g，河南宛西制藥，生產(chǎn)批號：150211，國藥準字Z41020696）；注射用醋酸曲普瑞林[gonadotropinreleasing hormone（GnRH），商品名：達菲林]，每瓶3.75 mg，法國益普生生物制藥公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：H16290，進口藥品注冊證號：H20140298。CTX，每片0.2 g，由山西普德藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：04150403，國藥準字H14023686；（9.0 g/L）氯化鈉注射液（生理鹽水），每瓶100 mL規(guī)格，四川科倫藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號：C17093103-2，國藥準字H51021156。IX71倒置熒光顯微鏡，購自日本Olympus公司。

1.3 左歸丸劑量 按大鼠與人用藥劑量換算公式[3]，已知A組成人每60 kg體質量用藥量，欲估算B種動物每kg體質量用藥劑量，B鼠（g·kg-1）=6.25 ×A人（g·kg-1）≈ 1.875 g·kg-1，人劑量為18 g/60 kg，大鼠平均體質量為250 g。計算所得大鼠左歸丸給藥劑量為1.6 g·kg-1·d-1（設為中劑量），以此設定低劑量為0.8 g·kg-1·d-1、高劑量為3.2 g·kg-1·d-1。制粉劑后，分別以過濾水配制灌胃質量濃度：低劑量為0.1 g/mL、中劑量為0.2 g/mL、高劑量為0.4 g/mL。

1.4 分組 將實驗入組動物（121只）按隨機數(shù)字表隨機分為空白組，模型組，POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組，非POF左歸丸組，非POF達菲林組等8組。

1.5 造模與給藥

1.5.1 造模前給藥 POF達菲林組、非POF達菲林組需造模前給藥。達菲林配制濃度為0.75 g/L。從造模前第10天當天，POF達菲林組、非POF達菲林組每只大鼠給予肌肉注射0.5 mL達菲林藥液（釋放量為12.5 μg/d），僅1次（10 d后卵巢功能受抑制，處于動情間期）。其他各組同時給予肌肉注射0.5 mL 9.0 g/L生理鹽水，僅1次。

1.5.2 造模 模型組，POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組，參考文獻[4，5]建立化療源性POF大鼠模型。經(jīng)反復預實驗摸索，擬定既導致POF而動物死亡率又最低的最小化療劑量：第1天給予腹腔注射CTX負荷劑量50.0 mg/kg，后以5.0 mg/kg的維持劑量連續(xù)注射14 d，每日1次。而空白組、非POF左歸丸組及非POF達菲林組大鼠在造模期間僅以9.0 g/L生理鹽水2 mL連續(xù)腹腔注射15 d，每日1次。

1.5.3 造模后給藥 造模結束后，空白組、模型組給予過濾水灌胃，POF左歸丸低、中、高劑量組給予左歸丸藥液灌胃，POF達菲林組給予過濾水灌胃，非POF左歸丸組給予左歸丸藥液灌胃，非POF達菲林組給予過濾水灌胃，每次2 mL，連續(xù)灌胃60 d，每日1次。

1.6 觀察指標與方法 分別于灌胃30、60 d后，每組取半數(shù)雌鼠以雌∶雄=2∶1比例合籠交配，次日早晨肉眼觀察雌鼠陰道，取陰道涂片進行檢測。以肉眼發(fā)現(xiàn)陰栓，陰道涂片顯微鏡下發(fā)現(xiàn)精子為受孕標志，當日作為“受孕日”。持續(xù)合籠15 d，如檢測到陰栓及精子則停止試孕，單獨放置。合籠15 d結束后，解剖大鼠，裸眼觀察子宮情況，統(tǒng)計胚胎著床情況，計算受孕率。

1.7 統(tǒng)計方法 采用STATA.12統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗。當n≥40且所有T≥5時，用卡方檢驗基本公式或者四格表資料的卡方檢驗專用公式；當n≥40但1≤T＜5時，用卡方檢驗的連續(xù)校正或者Fisher確切概率法；當n＜40或者T＜1時，用Fisher確切概率法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 左歸丸干預化療源性POF大鼠受孕結果 見表1。

2.1.1 灌胃30、60 d后POF大鼠受孕率比較 化療結束30 d，與空白組比較，模型組受孕率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001，P＜0.05）；POF左歸丸低、中、高劑量組及POF達菲林組受孕率與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.105、0.228、0.228、0.061，P＞0.05）。非POF達菲林組及非POF左歸丸組受孕率為100%，與空白組一致。與模型組比較，POF左歸丸中、高劑量組，非POF達菲林組、非POF左歸丸組受孕率均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.029、0.029、0.000、0.001，P ＜ 0.05）。POF左歸丸低劑量組及POF達菲林組受孕率與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為 0.082、0.206，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組受孕率與POF達菲林組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P值分別為 0.62、0.335、0.335，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組灌胃30 d后受孕率組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

灌胃60 d后，與空白組比較，模型組受孕率降低，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.021，P＜0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組受孕率與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P值分別為 0.070、 1.000、 0.105、 0.105， P＞0.05）。 非POF達菲林組、非POF左歸丸組受孕率均為100%，與空白組一致。與模型組比較，非POF左歸丸組、非POF達菲林組受孕率均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為 0.021、0.002，P＜0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組受孕率與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P 值分別為 1.000、0.057、0.620、0.620，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組受孕率與POF達菲林組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P值分別為1.000、0.335、1.000，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組灌胃60 d后受孕率組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

模型組，POF左歸丸低、中、高劑量組，POF達菲林組灌胃30 d與60 d后受孕率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），其他各組灌胃30、60 d后受孕率均為100%。

2.1.2 各組大鼠累計受孕率比較 與空白組比較，模型組，POF左歸丸低、高劑量組，POF達菲林組累計受孕率降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P值分別為 0.000、0.007、0.023、0.003，P ＜ 0.05）。POF左歸丸中劑量組累計受孕率與空白組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.132，P＞0.05），考慮中劑量組療效更佳。非POF達菲林組、非POF左歸丸組受孕率均為100%，與空白組一致。與模型組比較，POF左歸丸中、高劑量組，非POF達菲林組，非POF左歸丸組累計受孕率均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為 0.002、0.027、0.000、0.000，P＜0.05）。POF左歸丸低劑量組、POF達菲林組累計妊娠率與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.121、0.121，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組累計受孕率與POF達菲林組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P值分別為1.000、0.094、0.500，P＞0.05）。POF左歸丸低、中、高劑量組累計受孕率組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P=0.286，P＞0.05）。

表1 左歸丸干預化療源性POF大鼠受孕情況Table 1 The results for Zuogui Pills intervening the pregnancy of chemotherapy-induced POF rats

2.2 裸眼觀察各組大鼠子宮形態(tài) 空白組大鼠子宮宮體紅潤，呈串珠狀，胚胎著床處子宮膨大，充血明顯，胚胎著床位點分布相對均勻，大小相對一致；模型組大鼠子宮顏色蒼白，宮體細長，懷孕大鼠子宮呈不規(guī)則串珠狀，充血較空白組少，胚胎著床位點量少且分布不均勻，大小不等；POF左歸丸各劑量組大鼠子宮宮體紅潤，呈串珠狀改變，胚胎著床位點分布較空白組稀疏且不均勻，大小相對一致；非POF達菲林組、非POF左歸丸組大鼠子宮宮體紅潤，呈串珠狀，充血明顯，胚胎著床位點分布均勻，大小相對一致；POF達菲林組大鼠宮體細長，顏色較蒼白，胚胎著床位點分布稀疏且不均勻。

3 討論

CTX引起的生殖功能障礙嚴重影響患者的生育健康和生存質量，積極防治化療源性POF、保存女性患者的生育能力的問題具有重要的意義。

中醫(yī)學認為腎氣充盛、沖任和調是卵巢功能表現(xiàn)正常的基礎。反之，腎氣虛及沖任失調則會導致卵巢功能調節(jié)異常或卵巢功能衰竭[6]。本課題組朱玲教授[7]認為腎精虧虛、天癸匱源、沖任虛憊是POF的病機基礎，POF的治療當以補腎為大法。

月經(jīng)情況、性激素水平、生殖能力都是反映卵巢功能的指征。對于有生育需求的POF女性患者來說，保存或改善生育力是最終目標。

本課題組前期研究[8]發(fā)現(xiàn)，左歸丸可修復免疫性POF小鼠卵巢免疫性炎癥損傷，上調卵泡及卵巢間質Bcl-2蛋白及下調Bax蛋白的表達，從而抑制卵泡的過快凋亡。另外，有研究[9]表明，左歸丸能顯著提高CTX化療源性POF大鼠性激素雌二醇（E2）含量，降低促卵泡激素（FSH）、促黃體生成素（LH）含量，從而改善化療所致的卵巢功能損害。陽松威等[10]發(fā)現(xiàn)左歸丸可有效增強CTX致POF模型小鼠卵巢組織Cx37 mRNA表達，上調Cx37蛋白在卵巢組織中的分布與表達，改善化療致POF模型小鼠卵巢組織縫隙連接功能，恢復卵巢功能。劉秀云等[11]通過動物實驗研究左歸丸抗CTX毒性，結果顯示POF左歸丸組FSH較模型組顯著下降。臨床運用左歸丸治療POF患者，可使患者FSH水平明顯降低，AMH值明顯升高，有效提高患者卵巢的儲備功能[2]。綜上可見，左歸丸可改善化療源性POF患者的卵巢功能。但最終能否起到保護患者生育力的作用、保障患者的生殖健康，值得進一步研究。本研究以生育力為觀察指標，研究左歸丸對CTX化療源性POF大鼠生育功能的影響。

本研究結果顯示模型組受孕率明顯低于空白組，表明CTX存在卵巢毒性，可損傷大鼠卵巢功能，降低受孕率；卵巢對細胞毒性藥物非常敏感，化療藥物烷化劑CTX可對卵巢造成不可逆的損害。有研究[12]發(fā)現(xiàn)使用烷化劑患者約40%發(fā)生POF，烷化劑可使年輕女性發(fā)生POF的風險增加9倍。吳倩等[8]研究發(fā)現(xiàn)CTX化療源性POF大鼠卵巢體積明顯縮小，閉鎖卵泡較正常增多，顆粒細胞層減少且排列紊亂。本研究結果還顯示，隨著時間推移，模型組灌胃60 d后受孕率與灌胃30 d后受孕率比較有一定的提高，但仍然低下，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明經(jīng)過CTX的毒性損傷后不經(jīng)特殊處理，大鼠的卵巢功能雖然有一定的改善，但生育力仍然低下。

本研究結果顯示，POF左歸丸中、高劑量組灌胃30 d后受孕率及累計受孕率較模型組明顯上升，表明左歸丸可以提高模型動物的受孕率，改善化療源性POF大鼠的生育能力，對化療藥物CTX所致大鼠卵巢功能毒性損傷具有一定的治療作用。

促性腺激素釋放激素類似劑（GnRHa）達菲林在臨床應用于POF預防和化療中，對生育力保護是否有效仍存在爭議，但使用外源性GnRHa已被證實可抑制內(nèi)源性促性腺激素FSH至絕經(jīng)前水平，使卵巢卵泡處于靜止狀態(tài)，減少化療毒性損傷。有Meta分析[13]顯示，使用GnRHa可以顯著減少年輕惡性腫瘤患者化療后POF的風險。本研究結果顯示，POF達菲林組灌胃30、60 d后受孕率及累計受孕率與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但受孕率均高于模型組，表明達菲林在一定程度上能提高CTX化療源性POF大鼠受孕率，改善化療源性卵巢功能損傷。

本研究結果顯示，POF左歸丸低、中、高3個劑量組受孕率組間比較，差異無統(tǒng)計學意義。但無論是灌胃30 d、60 d后受孕率或是累計受孕率，POF左歸丸中劑量組受孕率均最高，且實驗過程中發(fā)現(xiàn)POF左歸丸中劑量組大鼠的毛發(fā)、飲食及日常活動較POF左歸丸低、高劑量組表現(xiàn)更佳。POF左歸丸中劑量組的灌胃劑量是按照POF左歸丸藥品說明書中60 kg成年女性的口服劑量18 g/60 kg換算的，本研究結果表明左歸丸中劑量治療化療藥物CTX所致大鼠卵巢功能毒性損傷療效最佳。提示臨床常用劑量治療POF患者藥效可能最佳。劑量降低可能導致療效降低。劑量增高，療效未見明顯提升。

本研究裸眼觀察大鼠子宮形態(tài)結果顯示，CTX的毒性作用可致大鼠子宮蒼白、宮體細長，妊娠率下降，胚胎大小及著床位點不均勻。POF左歸丸各劑量組及POF達菲林組均能改善子宮血供，促進胚胎著床，但著床位點與空白組比較相對分布不均、局部可見宮體顏色較蒼白。

結合本課題組同期研究成果，認為CTX化療會降低大鼠受孕率，損傷大鼠卵巢功能，而左歸丸可調節(jié)化療源性POF大鼠內(nèi)分泌水平，促進卵泡及黃體生長，減少卵泡閉鎖，抑制卵泡凋亡（另文發(fā)表），從而修復卵巢功能，促進胚胎著床，提高受孕率，改善生育能力，對CTX所致大鼠卵巢功能毒性損傷具有一定的治療作用。基于此，本研究下一步將進一步深入探討其作用機制以及胚胎毒性（如活產(chǎn)率、畸胎情況）等問題?？梢姡嗅t(yī)藥防治POF是一個具有發(fā)展前景的研究方向，對防治化療源性POF、保存年輕女性患者生育力、提高生活質量具有重要意義。