基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)白花蛇舌草治療肝癌的分子機(jī)制

覃玉冰， 林煒基， 曾廣必， 孫偉鵬， 張璐， 葉小衛(wèi)

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

肝癌是病死率最高的惡性腫瘤之一。我國(guó)肝癌死亡率極高，給社會(huì)和醫(yī)療帶來沉重的負(fù)擔(dān)[1]。大部分肝癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期，無法接受根治性手術(shù)治療[2]?，F(xiàn)代中醫(yī)對(duì)肝癌治療強(qiáng)調(diào)“整體調(diào)治”、“扶正祛邪”，可以彌補(bǔ)西醫(yī)的許多不足[3]。

白花蛇舌草主要生長(zhǎng)于我國(guó)江南及兩廣地區(qū)，味苦性寒，具有清熱解毒、散結(jié)止痛、利尿除濕的功效，是臨床治療肝癌的常用中藥。研究其單味藥抗肝癌的分子作用機(jī)制對(duì)探討肝癌病機(jī)及加減白花蛇舌草的中藥方劑的配伍有較大的意義?，F(xiàn)代研究表明，白花蛇舌草可通過多種途徑起到抗腫瘤作用[4]，但目前尚未全面地闡明其作用機(jī)制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能運(yùn)用多種技術(shù)揭示“藥物—基因—靶點(diǎn)—疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[5]。因此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)白花蛇舌草治療肝癌多靶標(biāo)、多通路協(xié)同作用，以期為臨床及相關(guān)基礎(chǔ)研究提供參考，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物化學(xué)成分和活性成分的獲取 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP）分別以“白花蛇舌草”為關(guān)鍵詞檢索，獲得該藥物含有的化學(xué)成分的信息。考慮到中藥成分紛繁復(fù)雜，并非所有成分均能進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮作用，故選取同時(shí)滿足口服利用度（OB）大于30%、類藥性（DL）值大于0.18 2個(gè)條件的化學(xué)成分作為其活性成分。并通過Pubchem檢索出每一個(gè)活性成分的3D結(jié)構(gòu)，以mol2格式保存。

1.2 活性成分作用靶標(biāo)的獲取 將所有活性分子的3D結(jié)構(gòu)上傳到DRAR-CPI服務(wù)器，基于反向分子對(duì)接方法，對(duì)活性成分和蛋白相互作用的親和性進(jìn)行打分。按照服務(wù)器推薦，選定Z-score＜-0.5的蛋白作為白花蛇舌草活性分子的預(yù)測(cè)靶標(biāo)。通過Uniport數(shù)據(jù)庫檢索白花蛇舌草活性分子的預(yù)測(cè)靶標(biāo)的PDB ID，限定物種為“human”，從而獲取預(yù)測(cè)靶標(biāo)的相應(yīng)基因。

1.3 肝癌相關(guān)靶標(biāo)基因的獲取 分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫中以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞檢索與肝癌相關(guān)的靶標(biāo)基因。并與白花蛇舌草活性分子的預(yù)測(cè)靶標(biāo)基因進(jìn)行對(duì)比，篩選出共同靶標(biāo)基因，作為白花蛇舌草活性成分抗肝癌的潛在作用靶標(biāo)。

1.4 成分—作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將白花蛇舌草的活性成分與抗肝癌作用靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建其成分—作用靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 核心靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 基于String數(shù)據(jù)庫為背景網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，將白花蛇舌草抗肝癌的潛在靶標(biāo)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為“human”，檢索獲得蛋白相互作用關(guān)系，以TSV格式保存結(jié)果。再將其導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制“蛋白相互作用關(guān)系”網(wǎng)絡(luò)，然后使用Cytoscape的Network Analyzer工具進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，并根據(jù)連接度（degree）作為指標(biāo)調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)的大小、顏色，繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 分子對(duì)接 分子對(duì)接技術(shù)（molecular docking）是利用計(jì)算機(jī)模式識(shí)別和優(yōu)化技術(shù)，在三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中搜索能與特定藥物作用靶點(diǎn)在幾何和化學(xué)上相匹配的分子，實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)輔助藥物篩選（虛擬篩選）。因此，基于上述的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出degree值最高的5個(gè)靶標(biāo)，并導(dǎo)入System Dock Web Site服務(wù)器與白花蛇舌草活性分子進(jìn)行對(duì)接，并通過對(duì)結(jié)果中的Docking Score進(jìn)行分析，評(píng)估白花蛇舌草活性分子與核心靶標(biāo)之間的結(jié)合潛力。

1.7 生物學(xué)過程與通路分析 DAVID數(shù)據(jù)庫為大量的基因或蛋白提供系統(tǒng)全面的生物功能注釋信息，并能找出最顯著富集的生物學(xué)注釋。將白花蛇舌草的作用靶標(biāo)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGGK）通路富集分析，得到并保存結(jié)果。選取滿足P＜0.001的通路，并根據(jù)富集基因數(shù)的大小，由大到少排序，選取排名前20的通路，使用OmicShare網(wǎng)站繪圖。

1.8 成分—靶標(biāo)—通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過對(duì)富集基因數(shù)大小排名前20的KEGG通路的分析，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)檢索，篩選出可能與抗肝癌相關(guān)的通路，找出富集在這些通路上白花蛇舌草抗肝癌的靶點(diǎn)，并與相應(yīng)藥物的活性分子相配對(duì)，構(gòu)建出“成分—靶標(biāo)—通路”的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草活性成分分析 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中，以O(shè)B值大于30%、DL值大于0.18為篩選條件，收集白花蛇舌草的活性成分，其中符合條件的活性成分共有15個(gè)，如雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、2-羥基-3-甲基蒽醌、車葉草苷等。另外，本研究還選擇了部分OB值低于30%，但含量較高，具有較高藥理研究?jī)r(jià)值的活性成分，如雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷等。

2.2 潛在靶標(biāo)預(yù)測(cè) 在DRAR-CPI服務(wù)器中檢索白花蛇舌草活性分子對(duì)應(yīng)的潛在靶標(biāo)，共獲得829個(gè)，去除重復(fù)靶標(biāo)后，共獲得486個(gè)潛在靶標(biāo)。通過與GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中與肝癌相關(guān)基因的對(duì)比，篩選出抗肝癌的可能潛在靶基因73個(gè)，主要是腫瘤壞死因子α（TNF-α）、細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子147（CD147）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、染色質(zhì)解旋酶DNA結(jié)合蛋白1樣基因（CHD1L）、信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）等。

2.3 成分—靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 分別將白花蛇舌草活性成分和潛在靶標(biāo)的相關(guān)信息輸入Cytoscape軟件中，構(gòu)建白花蛇舌草的成分—靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。圖1結(jié)果顯示，圖中含有節(jié)點(diǎn)88個(gè)，邊線257條。其中，六邊形節(jié)點(diǎn)代表白花蛇舌草活性成分，圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶標(biāo)。邊線代表活性成分與潛在靶標(biāo)的相互關(guān)聯(lián)。由成分—靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖可知，同一活性成分可以作用于不同靶標(biāo)，同一靶標(biāo)也可對(duì)應(yīng)不同活性成分，體現(xiàn)出白花蛇舌草治療肝癌具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。

圖1 白花蛇舌草“成分—靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)Figure 1 “Component-target”network of Herba Hedyotis Diffusae

2.4 靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過String數(shù)據(jù)庫獲取白花蛇舌草活性分子與肝癌相關(guān)靶標(biāo)的相互關(guān)系，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)。圖2結(jié)果顯示，靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)中包含節(jié)點(diǎn)73個(gè)，邊線311條。其中圓形節(jié)點(diǎn)代表蛋白靶標(biāo)，邊線代表蛋白靶標(biāo)之間的相關(guān)性。節(jié)點(diǎn)的面積大小表示蛋白靶標(biāo)的degree值大小，節(jié)點(diǎn)面積越大，顏色越深，表示其degree值越大。通過比較degree值的大小，并結(jié)合現(xiàn)有的研究結(jié)果，推測(cè)白花蛇舌草抗肝癌與CD147、CHD1L、IL-6、TNF-α、STAT3這5個(gè)靶基因有關(guān)。

圖2 白花蛇舌草潛在靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Interaction network of candidate targets of Herba Hedyotis Diffusae

圖3 Docking Score值柱狀圖Figure 3 Histogram for Docking Score

2.5 分子對(duì)接 選取靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)中degree值最大的5個(gè)靶基因名稱——CD147、CHD1L、IL-6、TNF-α、STAT3，將其輸入 System Dock Web Site軟件，并與白花蛇舌草15個(gè)活性分子進(jìn)行分子對(duì)接。圖3結(jié)果顯示，共有9個(gè)（12%）的Docking Score值大于 7，36個(gè)（48%）的 Docking Score值在5.0～7.0之間，20個(gè)（27%）的 Docking Score值在4.25～5.0之間，10個(gè)（13%）的Docking Score值小于4.25。Docking Score值表示分子與靶標(biāo)之間結(jié)合能力的強(qiáng)弱，一般認(rèn)為Docking Score值大于4.25表示分子和靶標(biāo)具有一定的結(jié)合能力，大于5.0表示結(jié)合能力較強(qiáng)，大于7.0表示結(jié)合能力很強(qiáng)。因此，根據(jù)結(jié)果提示，白花蛇舌草的活性成分和靶標(biāo)之間具有良好的結(jié)合能力。

2.6 GO和KEGG通路富集分析 對(duì)白花蛇舌草活性分子的對(duì)應(yīng)靶標(biāo)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，以P＜0.05為篩選條件，篩選出富集基因數(shù)量較大的通路和生物過程。圖4結(jié)果顯示，細(xì)胞成分（CC）分析富集基因數(shù)量較大的有細(xì)胞核通路、細(xì)胞器膜通路、細(xì)胞外區(qū)通路等。圖5結(jié)果顯示，分子功能（MF）分析富集基因數(shù)量較大的有細(xì)胞膜通路、細(xì)胞核通路、細(xì)胞基質(zhì)通路等。圖6結(jié)果顯示，生物進(jìn)程（BP）分析富集基因數(shù)量較大的有正調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等。圖7結(jié)果顯示，由KEGG通路富集分析結(jié)果可知，神經(jīng)降壓素（NTS）信號(hào)通路、叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族蛋白（FoxO）信號(hào)通路、類胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）、絲/蘇氨酸蛋白激酶AKT信號(hào)通路、BCL信號(hào)通路、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（EPK）1信號(hào)通路等與白花蛇舌草治療肝癌的潛在靶標(biāo)的相關(guān)性明顯。

圖4 白花蛇舌草活性成分潛在靶標(biāo)GO通路富集分析的CC分析Figure 4 GO pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae based on cellular components（CC）analysis

圖5 白花蛇舌草活性成分潛在靶標(biāo)GO通路富集分析的MF分析Figure 5 GO pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae based on molecular function（MF）analysis

2.7 “成分—靶標(biāo)—通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 綜合考慮分析GO和KEGG通路富集分析的結(jié)果，篩選出可能具有抗肝癌作用的通路，并將其與白花蛇舌草的活性分子和相應(yīng)的潛在靶標(biāo)一一對(duì)應(yīng)，即活性分子與靶標(biāo)對(duì)應(yīng)，靶標(biāo)與可能通路對(duì)應(yīng)，從而構(gòu)建出白花蛇舌草治療肝癌的“成分—靶標(biāo)—通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖8。其中黃色菱形代表白花蛇舌草的活性成分，紅色圓形代表作用靶點(diǎn)，藍(lán)色圓形代表涉及的通路。如圖8顯示，白花蛇舌草治療肝癌涉及雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、2-羥基-3-甲基蒽醌、車葉草苷等活性成分15個(gè)，這些活性成分作用的靶標(biāo)有CD147、CHD1L、IL-6、TNF-α、STAT3等5個(gè)，這些靶標(biāo)主要被包含在NTS、FoxO、IGF、AKT、BCL、EPK1信號(hào)通路中。

3 討論

本研究收集到白花蛇舌草中具有抗肝癌的化學(xué)成分主要有雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、2-羥基-3-甲基蒽醌、車葉草苷等。研究表明，雞屎藤次苷、京尼平苷、車葉草苷等可以通過激活TLR-4通路增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，從而達(dá)到抗炎的功效[6]。現(xiàn)有化學(xué)實(shí)驗(yàn)研究也印證2-羥基-3-甲基蒽醌及苷類有抗腫瘤的活性及作用[7]。

圖6 白花蛇舌草活性成分潛在靶標(biāo)GO通路富集分析的BP分析Figure 6 GO pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae based on biological process（BP）analysis

圖7 白花蛇舌草活性成分潛在靶標(biāo)的KEGG通路富集分析Figure 7 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets of active components in Herba Hedyotis Diffusae

圖8 “成分—靶標(biāo)—通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Figure 8“Component-target-pathways”network

本研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草可通過CD147、IL-6、TNF-α、STAT3等靶標(biāo)作用達(dá)到抗肝癌的作用。一系列的研究顯示，CD147在肝癌患者體內(nèi)高表達(dá)，可誘導(dǎo)合成大量MMP和血管生成從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。馮越等[9]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示在肝癌患者中TNF-α水平明顯高于正常值，可與化療藥物協(xié)同作用抑制腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。此外，研究顯示STAT3有一定程度的促癌作用，如果特異性敲除小鼠的STAT3基因，肝癌的發(fā)展過程與野生型小鼠有明顯差異。乙型肝炎病毒的X蛋白可以調(diào)控IL-6的表達(dá)，當(dāng)IL-6濃度超過一定的閾值后就可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。根據(jù)本研究結(jié)果，推測(cè)白花蛇舌草可能通過提高體內(nèi)TNF-α水平或下調(diào)CD147、STAT3、IL-6的表達(dá)來發(fā)揮抗肝癌的作用。李秀萍等[11]對(duì)肝損傷的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草可調(diào)整CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞之間的平衡，降低血漿TNF-α和IL-6的水平，減少肝損傷。南錫浩等[12]研究證實(shí)白花蛇舌草可通過作用于JAK2/STAT3通路途徑而對(duì)T24造成影響。以上報(bào)道均與本研究結(jié)果相符合。

本研究結(jié)果顯示，與白花蛇舌草治療肝癌相關(guān)的通路有：NTS、FoxO、IGF、AKT、BCL、EPK1等。其中，NTS可以促進(jìn)炎癥因子釋放，形成的炎性微環(huán)境具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用[13]。肝癌細(xì)胞中FoxO 3a的表達(dá)下調(diào)會(huì)加速肝癌干細(xì)胞的更新過程，而類胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）對(duì)FoxO 3a的表達(dá)起反向調(diào)節(jié)的作用[14]。在BCL家族中，BCL-2具有抑制凋亡的作用，BAD可與BCL-2結(jié)合達(dá)到促進(jìn)凋亡的效果。AKT可以促進(jìn)BAD磷酸化，阻止其與BCL-2結(jié)合達(dá)到抑制凋亡的作用。研究顯示，在肝細(xì)胞性肝癌組中，BCL-2陽性表達(dá)率顯著高于膽管癌和肝硬化組[15，16]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，分析白花蛇舌草在抗肝癌治療方面的有效化學(xué)成分和分子機(jī)制，結(jié)果顯示白花蛇舌草中具有治療肝癌作用的化學(xué)成分可能是雞屎藤次苷、多孔甾醇、京尼平苷、京尼平、車葉草苷等。此藥可能通過CD147、IL-6、TNF-α、STAT3、CHD1L等靶標(biāo)及NTS、FoxO、IGF、AKT、BCL、EPK1等信號(hào)通路起治療作用。通過相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建可直觀地顯示出白花蛇舌草治療肝癌具有多成分、多途徑等共同作用的特點(diǎn)，符合中醫(yī)藥治療疾病的特點(diǎn)，相比西藥的單基因—單靶點(diǎn)的作用機(jī)制，優(yōu)勢(shì)明顯。本研究通過分子對(duì)接驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)的可靠性，所得結(jié)果也與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道高度符合，但本研究結(jié)果只是一種分子機(jī)制上的預(yù)測(cè)探討，藥物具體作用機(jī)制的確認(rèn)仍需通過進(jìn)一步驗(yàn)證。