醒脾解郁湯對(duì)肝部分切除老年小鼠認(rèn)知功能和神經(jīng)元損傷的影響

李秀菊， 高源， 趙雪， 王領(lǐng)， 宗傳赪

（武漢市第八醫(yī)院麻醉科，湖北武漢 430010）

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指術(shù)后學(xué)習(xí)能力、記憶力、執(zhí)行力以及認(rèn)知能力等受到損傷。大多數(shù)患者可在術(shù)后3個(gè)月后恢復(fù)，極少數(shù)患者為永久性認(rèn)知功能障礙，是老年患者最為常見的術(shù)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，對(duì)術(shù)后康復(fù)以及生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響[1，2]。以往研究報(bào)道術(shù)后早期的POCD與細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性等密切相關(guān)，臨床上尚缺乏有效的治療藥物[3]。醒脾解郁湯是基于對(duì)認(rèn)知功能障礙肝郁脾濕病機(jī)的認(rèn)識(shí)而擬定的有效方劑。本研究通過觀察醒脾解郁湯對(duì)模擬POCD的肝部分切除老年小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶行為和細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響，探討醒脾解郁湯對(duì)POCD的影響及其分子機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 C57BL/6J小鼠40只，雌雄各半，鼠齡18個(gè)月，體質(zhì)量30～35g，購(gòu)自湖北省疾控中心。動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：42816300002523。于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)完成實(shí)驗(yàn)。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠的處理嚴(yán)格遵循動(dòng)物福利與倫理準(zhǔn)則和指南的相關(guān)規(guī)定。所有小鼠被隨機(jī)分為5組，即假手術(shù)組、肝切除組及醒脾解郁湯低、中、高劑量組，每組8只。

1.2 藥物、試劑與儀器 醒脾解郁湯由石菖蒲10 g、西洋參15 g、郁金12 g、熟地黃15 g組成，各中藥材購(gòu)自湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG、BCA蛋白定量試劑盒和RIPA裂解液（武漢Bio-swamp公司）；兔抗caspase 3多克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）多克隆抗體和兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（gelatinous fiber acid protein，GFAP）單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司）；兔抗GAPDH多克隆抗體（美國(guó)Proteintech公司）。SMART 3.0小動(dòng)物行為視頻分析系統(tǒng)（西班牙PANLAB公司）；電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；MK3酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司）；Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能公司）。1.3 模型建立 根據(jù)文獻(xiàn)[4，5]方法建立肝葉部分切除術(shù)小鼠模型。具體步驟：肝切除組，醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠給予腹腔注射0.2 mg/kg芬太尼和5 mg/kg氟哌利多，待小鼠的翻正反射消失后進(jìn)行固定。對(duì)小鼠腹部進(jìn)行消毒，在劍突下切開2 cm，打開小鼠腹腔分離其肝臟左外側(cè)葉，用7號(hào)絲線在遠(yuǎn)端蒂部進(jìn)行結(jié)扎，將結(jié)扎外側(cè)的肝臟組織切除，徹底止血后用3號(hào)絲線對(duì)切口進(jìn)行逐層縫合，并進(jìn)行常規(guī)消毒。假手術(shù)組小鼠進(jìn)行手術(shù)但不切除肝葉。

1.4 給藥 醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠于術(shù)前6 d開始至術(shù)后2 d每天分別灌胃3.6、7.2、14.4 g·kg-1·d-1的醒脾解郁湯，假手術(shù)組和肝切除組小鼠灌胃等體積生理鹽水。藥物劑量換算根據(jù)文獻(xiàn)[6]計(jì)算得出。

1.5 水迷宮實(shí)驗(yàn) 所有小鼠于術(shù)前6 d開始進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，每天4次。每次讓小鼠面向池壁入水，令其尋找置于第Ⅰ象限水面下1 cm處的平臺(tái)，所耗時(shí)間記為逃逸潛伏期。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定最大時(shí)限為90 s（即在90 s內(nèi)未找到平臺(tái)者停止記錄，并將逃逸潛伏期記為90 s）。術(shù)后第2天撤去平臺(tái)，選取原平臺(tái)正對(duì)象限為動(dòng)物入水點(diǎn)，讓動(dòng)物自由游泳90 s，記錄90 s內(nèi)動(dòng)物穿過平臺(tái)區(qū)的次數(shù)，并記錄逃逸潛伏期。

1.6 Western Blot實(shí)驗(yàn) 對(duì)各組小鼠的海馬組織進(jìn)行蛋白提取，采用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。每孔上樣30 μL蛋白樣品，12%的十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。0.5 g/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌后分別加入一抗（caspase 3稀釋比：1∶500；Bax稀釋比：1∶2 000；Bcl-2稀釋比：1∶2 000；NeuN稀釋比：1∶1 000；GFAP稀釋比：1∶10 000），4℃孵育過夜。TBST再次洗滌后，加入HRP標(biāo)記的特異性二抗IgG室溫孵育1 h，洗膜。ECL化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，拍照保存。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組的組間比較采用單因素方差，均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 醒脾解郁湯對(duì)肝部分切除老年小鼠認(rèn)知功能的影響 表1結(jié)果顯示：手術(shù)后第2天，與假手術(shù)組小鼠比較，肝切除組小鼠的逃逸潛伏期明顯延長(zhǎng)，小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與肝切除組小鼠比較，醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠的逃逸潛伏期顯著縮短，小鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)顯著增多，且呈劑量依賴性。

表1 醒脾解郁湯對(duì)肝部分切除老年小鼠認(rèn)知功能的影響Table 1 The effect of SDD on the cognitive function of aged mice with partial hepatectomy （±s）

表1 醒脾解郁湯對(duì)肝部分切除老年小鼠認(rèn)知功能的影響Table 1 The effect of SDD on the cognitive function of aged mice with partial hepatectomy （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與肝切除組比較；③P＜0.05，與醒脾解郁湯低劑量組比較

穿臺(tái)次數(shù)（n/次）8.51±0.73 4.22±0.65①5.91±0.67①6.46± 0.82①②7.57± 0.97②③組別假手術(shù)組肝切除組醒脾解郁湯低劑量組醒脾解郁湯中劑量組醒脾解郁湯高劑量組N88888逃逸潛伏期（t/s）27.57±4.54 39.18±3.76①35.79±3.87①33.09± 3.72①②30.71± 3.83②③

2.2 醒脾解郁湯對(duì)肝部分切除老年小鼠凋亡相關(guān)蛋白的影響 圖1結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，肝切除組小鼠海馬組織中Bax、caspase 3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與肝切除組比較，醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠海馬組織中Bax和caspase 3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

2.3 醒脾解郁湯對(duì)肝部分切除老年小鼠NeuN、GFAP蛋白表達(dá)的影響 圖2結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，肝切除組小鼠海馬中NeuN蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），GFAP蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與肝切除組比較，醒脾解郁湯低、中、高劑量組小鼠海馬組織中NeuN蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），GFAP蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

3 討論

醒脾解郁湯中的石菖蒲、西洋參、郁金和熟地黃是治療認(rèn)知障礙的常用中藥，在治療多種類型認(rèn)知障礙疾病中具有較好的療效[7，8]。本研究采用國(guó)內(nèi)外認(rèn)可的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[9]評(píng)價(jià)醒脾解酒湯肝部分切除老年小鼠的空間學(xué)習(xí)能力以及記憶能力，結(jié)果表明，醒脾解郁湯干預(yù)能夠顯著縮短肝部分切除老年小鼠的逃逸潛伏期，增加穿臺(tái)次數(shù)，提示醒脾解郁湯能有效改善肝部分切除術(shù)后小鼠的認(rèn)知功能障礙。

POCD的具體發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，但已有研究顯示其發(fā)生可能與海馬神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與學(xué)習(xí)記憶能力等認(rèn)知功能密切相關(guān)的重要部位，海馬神經(jīng)元凋亡增加是機(jī)體認(rèn)知功能障礙的機(jī)制之一[10，11]。NeuN是神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，是一種表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)大多數(shù)神經(jīng)元胞核和胞漿中的特異性蛋白質(zhì)[12]。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞中最重要的骨架蛋白，其表達(dá)的強(qiáng)弱代表星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)，被認(rèn)為是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物[13]。星形膠質(zhì)細(xì)胞參與組成細(xì)胞骨架，在大腦的神經(jīng)發(fā)育中對(duì)神經(jīng)元遷移具有引導(dǎo)作用，對(duì)神經(jīng)元分化具有促進(jìn)作用，可分泌多種生長(zhǎng)因子和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元具有支持和營(yíng)養(yǎng)的作用，同時(shí)還可以通過調(diào)劑細(xì)胞內(nèi)外離子平衡加強(qiáng)受損神經(jīng)元的修復(fù)和再生，并對(duì)神經(jīng)元的興奮性具有調(diào)節(jié)作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時(shí)，GFAP呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)[14，15]。Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡中的2個(gè)關(guān)鍵因子，它們分別是抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因[16]。caspase 3被認(rèn)為是各種凋亡刺激因子激活的caspase家族中的關(guān)鍵蛋白酶[17]。本研究結(jié)果顯示不同劑量醒脾解郁湯可顯著降低肝切除術(shù)后小鼠海馬組織中Bax、caspase 3和GFAP蛋白表達(dá)水平，顯著升高Bcl-2和NeuN蛋白表達(dá)水平，且呈劑量依賴性，表明醒脾解郁湯可減少肝切除老年小鼠海馬中細(xì)胞凋亡以及增加海馬中神經(jīng)元。

圖1 各組小鼠海馬組織中Bax、Bcl-2和caspase 3蛋白的表達(dá)Figure 1 Comparison of the expression levels of caspase 3，Bax and Bcl-2 proteins in mouse hippocampus of various groups

圖2 各組小鼠海馬組織中NeuN和GFAP蛋白的表達(dá)Figure 2 Comparison of the expression levels of NeuN and GFAP proteins in mouse hippocampus of various groups

綜上所述，醒脾解郁湯可通過減少肝切除老年小鼠海馬中細(xì)胞凋亡以及增加海馬中神經(jīng)元來減輕其術(shù)后導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙。