Camk2b低表達對1,4-苯醌致K562細胞線粒體毒性的影響

張 虹，王 彤，王 坤，王博深，章夢瑩，周燕華，浦躍樸，張 娟*

(東南大學公共衛(wèi)生學院，環(huán)境醫(yī)學工程教育部重點實驗室，江蘇 南京 210009)

苯是一種常見的工業(yè)基本原料，也是環(huán)境中重要的污染物，苯通過不同途徑進入機體后，經過一系列代謝，最后在骨髓生成終致癌物1,4-苯醌(1,4-benzoquinone，1,4-BQ)[1-2]。慢性苯暴露可影響骨髓造血功能，引起白細胞減少，再障，骨髓增生異常綜合征，甚至白血病[3-6]。1,4-BQ可以誘導K562細胞活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)增加，導致線粒體損傷和細胞凋亡增加[7]。鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶2(calcium/calmodulindependentproteinkinase2，Camk2)是一種多功能蛋白激酶，能夠根據Ca2+濃度的改變傳遞不同的細胞信號[8-9]，細胞內鈣離子的超載會造成線粒體功能障礙，從而導致細胞凋亡[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，苯暴露可致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺陷小鼠骨髓細胞Camk2b的表達降低[11]，故本研究通過構建Camk2b低表達K562細胞，在不同濃度的1,4-BQ染毒后檢測細胞增殖、活性氧、ATP、線粒體膜電位、凋亡的改變，探討Camk2b低表達對苯致K562細胞線粒體毒性的影響，初步研究Camk2b對于細胞抗氧化損傷的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

K562細胞株，購自中國科學院上海細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購于美國Gibco公司。青霉素、鏈霉素均購于美國Hyclone公司。PrimeScriptTMRTMasterMix、SYBR?PremixExTaqTM均購于日本TaKaRa公司?；钚匝鯔z測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、Fluo-3AM鈣離子熒光探針均購于上海碧云天公司。ATP檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購于江蘇凱基公司。Anti-CamkⅡbeta antibody、Anti-betaActinantibody均購于美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光定量PCR法檢測K562細胞Camk2b mRNA水平的表達 選取狀態(tài)良好的K562細胞，用含有5%(體積分數(shù))血清和0.5%(體積分數(shù))雙抗的1640培養(yǎng)基重懸，以每孔3×105個細胞、2mL培養(yǎng)液接種于6孔板。分別以0、10、20μmol/L1,4-BQ染毒，每個濃度設置3個平行，培養(yǎng)24h，收集細胞后加入Trizol提取RNA，引物序列見表1，逆轉錄(體系為500ngRNA，20 μL5×PrimeScriptRTMastermix，無酶水補充至體系總體積為20μL)后進行熒光定量PCR反應，反應條件為：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s；共40個循環(huán)。以β-actin為內參，用 2-ΔΔCT法計算Camk2bmRNA的相對表達水平。

表1 基因引物序列

1.2.2 熒光定量PCR法檢測KN93干預細胞Camk2b mRNA表達水平 根據參考文獻[12-13]及預實驗，選擇15μmol/L濃度的抑制劑KN93干預細胞，設置3個平行，培養(yǎng)24h。收集細胞后加入Trizol提取RNA，引物序列同表1，逆轉錄及熒光定量PCR反應同1.2.1。 以 β-actin 為 內參， 用 2-ΔΔCT法計算Camk2b mRNA的相對表達水平。

1.2.3 Westernblot法檢測KN93干預細胞Camk2b蛋白的表達水平 以15μmol/L濃度的抑制劑KN93干預細胞，設置3個平行，培養(yǎng)24h。收集細胞后加入RIPA提取蛋白，通過BCA法檢測蛋白濃度，取25g蛋白上樣，通過制備濃縮膠和分離膠，SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠)電泳(條件為70V、30min，100V、60min)，轉膜(條件為90V、3h)，5%脫脂奶粉封閉，分別加入1∶1000稀釋Camk2b的一抗和1∶2000稀釋β-actin的一抗4℃孵育過夜，1×TBST緩沖液清洗后用1∶5000稀釋的二抗孵育1h，1×TBST和1×TBS緩沖液清洗后曝光，測定細胞蛋白表達量。

1.2.4 細胞分組及處理 將Camk2b低表達細胞和對照細胞分別以0、10、20μmol/L1,4-BQ染毒，共分為 0、 10、 20 μmol/L1,4-BQ， KN93， KN93+10 μmol/L，KN93+20μmol/L1,4-BQ共6個組，每個組設置3個平行，抑制劑KN93提前1h加入。

1.2.5 MTT法檢測細胞增殖抑制率 以每孔8000個細胞、200μL培養(yǎng)液的濃度接種于96孔板，分組同1.2.4，每組設置3個平行，同時用培養(yǎng)基設置空白對照組，用PBS加在各組最外圈防止邊緣效應，各實驗組細胞分別培養(yǎng)24h。干預24h后每孔加入20μL MTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔板以1500r/min離心10min，去上清，每孔加入150 μLDMSO溶液溶解藍紫色結晶，在490nm波長測定吸光度D(490)值，按公式計算細胞相對增殖率。

1.2.6 細胞活性氧檢測 按照1∶1000的稀釋比用無血清培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，培養(yǎng)2h后每個平行收集1×105個細胞，1500r/min離心，5min，去除上清。將離心后的細胞重懸于稀釋后的DCFH-DA中，細胞濃度為1×106/mL，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育20min。在孵育期間，每隔3～5min顛倒混勻一下，使細胞和探針充分接觸。孵育結束后，洗滌細胞3次，1500r/min離心5min，盡快上機檢測。

1.2.7 細胞ATP檢測 細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，培養(yǎng)24h后每個平行收集2×105個細胞并離心，棄上清，每2×105個細胞加入200μL裂解液，待裂解充分后，4℃、12000g離心5min，輕輕吸取上清待用。將ATP標準溶液稀釋成0.01、0.05、0.2、1、5、10和50μmol/L幾個濃度，用于測定標準曲線。按照ATP檢測試劑：ATP檢測試劑稀釋液=1∶9的比例配制適當量的ATP檢測工作液，每個樣品/標準品100μL。在檢測孔內加上40μL樣品和標準品，迅速混勻，間隔3s后，用微孔板式發(fā)光檢測儀檢測。

1.2.8 細胞JC-1膜電位檢測 用超純水稀釋溶解并混勻JC-1，再加入2mLJC-1染色緩沖液(5X)，配制染色工作液。細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，染毒結束24h后，每個平行收集2×105個細胞重懸于0.5mL細胞培養(yǎng)液中，再加入0.5mLJC-1染色工作液，混勻，37℃孵育20min。按照JC-1染色緩沖液(5X)∶蒸餾水=1∶4的比例，配制JC-1染色緩沖液(1X)，冰上保存。37℃孵育結束后，600g、4℃離心3～4min，棄上清，用JC-1染色緩沖液(1X)洗滌細胞，600g、4℃離心3min，再重復洗滌一次。用適量JC-1染色緩沖液(1X)重懸細胞，盡快用流式細胞儀檢測。綠色熒光值越高，細胞線粒體膜電位越低。

1.2.9 細胞內鈣離子濃度檢測 細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，染毒24h后每個平行收集等量的細胞，離心5min，棄上清。將5mmol/L的Fluo-3AM熒光探針用DMSO稀釋成5μmol/L待用，注意避光保存。Fluo-3可以和鈣離子結合，結合鈣離子后可以產生較強的熒光。用稀釋好的5μmol/L的Fluo-3AM熒光探針重懸細胞，37℃孵育50min，無菌PBS洗滌細胞，再孵育20min，盡快用流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度。

1.2.10 細胞凋亡率檢測 細胞分組同1.2.4，每組設置3個平行，染毒24h后每個平行收集(1～5)×105個細胞，1500r/min離心5min，PBS洗滌兩次，1500r/min離心5min。每個平行加入500μL的BindingBuffer和5μLAnnexinV-PE混勻后，加入5μLPI染液混勻，室溫、避光、反應5～15min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率。AnnexinV是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標，用熒光素APC標記；PI是一種核酸染料，能透過晚期凋亡細胞和死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。AnnexinV陽性PI陰性為早期凋亡細胞，AnnexinV和PI雙陽性為晚期凋亡細胞。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 K562細胞Camk2bmRNA水平的表達

通過qPCR法檢測Camk2bmRNA的表達，結果如圖1所示，在1,4-BQ染毒后，與未染毒組比較，K562細胞Camk2bmRNA表達量明顯下降，呈劑量反應關系，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖1 1,4-BQ染毒K562細胞后Camk2bmRNA的相對表達水平

2.2 KN93干預后K562細胞Camk2bmRNA水平的表達

通過qPCR法檢測Camk2bmRNA的表達，在15 μmol/LKN93干預后，K562細胞Camk2bmRNA表達量與對照組比較，下降71%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，如圖2所示。

圖2 KN93干預K562細胞后Camk2bmRNA的相對表達水平

2.3 KN93干預后K562細胞Camk2b蛋白水平的表達

通過Westernblot法檢測Camk2b蛋白表達的結果如圖3所示，在15μmol/LKN93干預后，K562細胞Camk2b蛋白表達量與對照細胞比較，下降46%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

圖3 KN93干預K562細胞后Camk2b蛋白的相對水平表達

2.4 KN93干預對苯致K562細胞增殖活性的影響

MTT實驗結果如圖4所示，在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞和對照細胞都出現(xiàn)明顯的增殖抑制作用，且呈劑量反應關系。與對照細胞相比，Camk2b低表達細胞在相同濃度1,4-BQ作用下細胞增殖率降低(P＜0.01)。

圖4 KN93對苯致K562細胞增殖活性的影響

2.5 KN93干預對苯致K562細胞ROS的影響

流式細胞術檢測結果如圖5所示，在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞和對照細胞產生的ROS均增加，在10μmol/L的濃度下ROS上升為原來的1.41倍和1.6倍，Camk2b低表達細胞的活性氧上升更為明顯(P＜0.05)。在20μmol/L的濃度下，對照細胞產生的活性氧仍在上升，而Camk2b低表達細胞產生的活性氧則開始下降，但仍然高于未染毒細胞。

圖5 流式細胞術檢測Camk2b抑制劑KN93對苯染毒后K562細胞ROS的影響

2.6 KN93干預對苯致K562細胞ATP的影響

用微孔板式發(fā)光檢測儀檢測細胞線粒體的ATP生成量，如圖6所示。Camk2b低表達細胞線粒體ATP生成量低于對照細胞(P＜0.01)。在1,4-BQ染毒后，兩種細胞線粒體ATP生成量均降低，且呈劑量反應關系。但在相同濃度1,4-BQ染毒后，與對照細胞比較，Camk2b低表達細胞線粒體ATP生成量更低(P＜0.01)。

圖6 Camk2b抑制劑KN93對苯致K562細胞ATP生成量的影響

2.7 KN93干預對苯致K562細胞線粒體膜電位的影響

流式細胞儀檢測結果如圖7所示，相較于對照細胞，Camk2b低表達細胞的綠色熒光值更高，提示Camk2b抑制劑KN93干預后，線粒體膜電位下降(P＜0.01)。隨著1,4-BQ染毒濃度的增加，紅色熒光減弱，綠色熒光增強，紅綠熒光比值降低，說明兩種細胞線粒體膜電位均降低，且呈劑量反應關系。在10 μmol/L1,4-BQ染毒后，與對照細胞比較，Camk2b低表達細胞線粒體膜電位下降更顯著(P＜0.05)。但在20 μmol/L1,4-BQ染毒后，兩種細胞線粒體膜電位都明顯下降，差異沒有統(tǒng)計學意義。

圖7 Camk2b抑制劑KN93對苯致K562細胞線粒體膜電位的影響

2.8 KN93干預對苯致K562細胞內鈣離子濃度的影響

流式細胞術檢測結果如圖8所示，Camk2b低表達細胞內的鈣離子濃度高于對照細胞(P＜0.01)。在1,4-BQ染毒后，兩種細胞內鈣離子濃度均增加，且呈劑量反應關系，但在相同濃度1,4-BQ染毒后，與對照細胞比較，Camk2b低表達細胞內鈣離子濃度更高(P＜0.01)。

2.9 KN93干預對苯致K562細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果如圖9所示，Camk2b低表達細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率都高于對照細胞，提示抑制Camk2b基因后細胞凋亡明顯增加。在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞和對照細胞的晚期凋亡率都增加，且呈劑量反應關系，而且與對照細胞比較，Camk2b低表達細胞在相同濃度1,4-BQ染毒后晚期凋亡率更高。而Camk2b低表達細胞早期凋亡率在20 μmol/L的濃度開始下降，由早期凋亡逐漸轉變?yōu)橥砥诘蛲觥?/p>

3 討論

線粒體主要功能是高效地為細胞生命活動的提供能源ATP與細胞中氧自由基的生成，調節(jié)細胞氧化還原電位和信號轉導、細胞內多種離子的跨膜轉運及電解質穩(wěn)態(tài)平衡，調控細胞凋亡[14-15]。線粒體損傷主要表現(xiàn)在氧化磷酸化障礙，ATP生成受阻，膜電位降低，鈣離子濃度失衡，導致細胞凋亡或壞死[16-17]。

圖8 Camk2b抑制劑KN93對苯致K562細胞內鈣離子濃度的影響

圖9 Camk2b抑制劑KN93對苯致K562細胞凋亡的影響

本次研究中，首先發(fā)現(xiàn)在1,4-BQ染毒后，K562細胞Camk2bmRNA表達量下降。建立Camk2b低表達細胞模型，發(fā)現(xiàn)在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達與對照細胞增殖都受到明顯的抑制，ATP生成減少，線粒體膜電位下降，產生的活性氧增加，出現(xiàn)明顯的線粒體損傷。Camk2b低表達細胞由于鈣/鈣調素依賴蛋白激酶受到抑制，在20μmol/L1,4-BQ染毒后，ATP生成急劇減少，線粒體膜電位顯著下降，胞內鈣離子過載，表現(xiàn)為更加明顯的線粒體損傷。適當濃度的ROS是細胞正常生理過程所必須的，過度的ROS產生可能導致細胞功能障礙或死亡[18]。本研究中1,4-BQ染毒后ROS顯著升高，可引起過度的氧化應激，但20 μmol/L1,4-BQ染毒之后，Camk2b低表達細胞與正常表達組相比，ROS水平出現(xiàn)下降，這可能與高濃度1,4-BQ對線粒體有氧呼吸的抑制有關。

鈣離子是普遍存在的參與控制多種生理過程的第二信使，通過抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白微調細胞內鈣離子的穩(wěn)態(tài)[19]。鈣離子的過載導致細胞活性氧的產生增加以及線粒體鈣離子循環(huán)可能通過通透性轉換孔的開放導致線粒體去極化，最終導致線粒體功能障礙和細胞凋亡，產生不利影響[20-21]。細胞內鈣濃度的變化調節(jié)細胞信號傳導過程，包括細胞增殖，遷移和死亡[22]。有研究顯示，Camk2b具有廣泛的生物學功能，是細胞增殖的重要調節(jié)因子[23]，抑制Camk2b的活性會限制白血病細胞的增殖，并導致生長停滯和分化[24]。本研究顯示在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞會出現(xiàn)更高的細胞凋亡率和增殖抑制率。

綜上所述，在1,4-BQ染毒后，Camk2b低表達細胞出現(xiàn)更明顯的線粒體損傷，Camk2b對于細胞的抗氧化損傷具有重要意義。